调节Matriptase-2表达，活化以及胞外段脱落（酶切）的分子学机制研究

【摘要】目的：Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶（TypeⅡTransmembraneSerineProtease，TTSPs）是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的蛋白酶，在哺乳动物的许多病理、生理过程中扮演着重要的角色，其功能异常可导致癌症、缺铁性贫血、耳聋、心血管疾病等。在人类，TTSPs共有17个成员，其中对matriptase-2的研究比较少，目前对其生物学功能的了解，主要是它可以通过调控hepcidin的表达来调节体内铁稳态；除此之外，有研究表明它在乳腺癌和睾丸癌的发生发展过程中也起到一定的作用，但在这些疾病的发生发展中，matriptase-2的具体生物学功能并不明确。目前已知，matriptase-2的活化和胞外段脱落是其发挥自身功能的前提条件，但是对于调节matriptase-2表达，活化和胞外段脱落（酶切）的分子机制仍不清楚。本研究旨在探究调节matriptase-2的表达，活化以及胞外段脱落（酶切）的分子学机制。方法：（1）利用RT-PCR，PCR从人肝脏组织中提取出matriptase-2基因，然后连接到带有V5标签的真核表达质粒中；（2）matriptase-2重组质粒转染HEK293和肝癌细胞，然后利用细胞免疫荧光技术检验matriptase-2在这些细胞中能否成功表达；（3）免疫共沉淀收集条件培养基中的可溶性matriptase-2片段；（4）用生物素标记和免疫共沉淀分离、提取膜蛋白；（5）利用蛋白酶抑制剂，免疫共沉淀以及westernblot探究哪类蛋白酶抑制剂能抑制matriptase-2胞外段脱落；（6）利用点突变阻断对matriptase-2活性至关重要的两个位点，用来探究matriptase-2能否自身活化；同样地，利用点突变分别阻断matriptase-2上的七个糖基化修饰位点，用来研究各个糖基化位点对matriptase-2的表达，活化和胞外段脱落（酶切）的影响；（7）Westernblot分析matriptase-2在细胞裂解液，上清以及膜蛋白中的表达，活化以及胞外段脱落情况；结果：（1）利用RT-PCR和PCR成功从人肝组织中提取到matriptase-2cDNA，连接到带有V5标签的质粒后，经测序所有的碱基序列与人matriptase-2基因序列保持一致。（2）重组matriptase-2质粒转染到人胚肾细胞HEK293和肝癌细胞BEL7402后，利用细胞免疫荧光检测到锚定于细胞膜上的matriptase-2，这表明我们所建立的细胞模式很成功，能够用于以后的实验。（3）用Westernblot和免疫共沉淀分析matriptase-2在HEK293和肝癌细胞（BEL-7402、SMMC-7721、QGY-7703）中的活化情况。结果表明matriptase-2在HEK293细胞中的活化和胞外段脱落（酶切）情况与在肝癌细胞中是一致的；其中~30kDa条带为matriptase-2的活化条带。（4）利用免疫共沉淀和westernblot，检测在条件培养基中加入各种蛋白酶抑制剂（GM6001、ALLM、benzamidine(benz)、TAPI-1）后，上清中是否存在可溶性Matriptase-2片段。结果显示，在加入丝氨酸蛋白酶抑制剂（benzamidine）后，条件培养基（opti-MEM，没有血清的培养基）中的可溶性matriptase-2均显著减少；而加入其它蛋白酶抑制剂后，条件培养基中的matriptase-2保持不变。（5）利用点突变得到致使matriptase-2失去活性的R576A和S762A（R576—活化酶切位点被突变掉；S762A—催化区中对自身活性至关重要的一个位点被突变掉）。然后，通过westernblot检测这两个突变体的条件培养基中是否存在可溶性matriptase-2片段。结果显示，两个突变体的条件培养基（opti-MEM，没有血清的培养基）中均没有可溶性matriptase-2片段。（6）利用生物素标记提取膜蛋白，然后westernblot分析matriptase-2在细胞膜上的活化情况。结果显示，在表达野生型matriptase-2的HEK293和BEL7402的膜蛋白中，检测到~30kDa的条带；在表达matriptase-2的两个突变体（R576A、S762A）的膜蛋白中，没有检测到~30kDa的条带。~30kDa条带为matriptase-2的活化条带。（7）利用westernblot分析matriptase-2的糖基化修饰类型。结果显示，在加入PNGaseF的细胞裂解液中，matriptase-2的分子量下降；加入O-glycanase的细胞裂解液中，matriptase-2的分子量没有变化；而在加入PNGaseF+O-glycanase的细胞裂解液中，matriptase-2的分子量亦下降，鉴于糖基化修饰分为N-糖基化修饰和O-糖基化修饰，故而我们得出matriptase-2的糖基化修饰主要是N-糖基化修饰。（8）利用点突变分别阻断matriptase-2的七个糖基化修饰位点，得到N136Q、N184Q、N216Q、N338Q、N433Q、N453Q、N518Q七个突变体，然后通过免疫共沉淀和westernblot分析这七个糖基化修饰位点对其表达，活化和胞外段脱落（酶切）的影响。结果表明这些糖基化修饰位点并不影响matriptase-2表达以及在细胞膜上的锚定。然而，N216Q、N453Q和N518Q却能明显抑制matriptase-2的活化，进而阻止了matriptase-2从细胞膜上的脱落（酶切），而其他5个突变体并没有影响到matriptase-2的活化和酶切。结论：我们比较系统全面地研究了matriptase-2在HEK293和肝癌细胞中的活化和酶切情况，我们发现matriptase-2在胞浆中无法被活化，但是锚定在膜上后可以通过自我酶切使自身活化，并且活化的matriptase-2可以酶切自身进而与胞膜脱落。我们也发现了N-糖基化修饰对matriptase-2的活化和胞外段脱落（酶切）具有重要的影响但并不影响其表达以及到膜上的锚定。总之，我们的结果为研究调节matriptase-2的表达，活化，胞外段脱落（酶切）的分子机制提供了新的见解。
【作者】姜江；
【导师】冯萍；申咏梅；
【作者基本信息】苏州大学，临床检验诊断学，2014，硕士
【关键词】Matriptase-2；Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶；糖基化修饰；

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