NDV 7793株刺激小鼠NK细胞TRAIL表达及杀伤肝癌细胞的实验研究

【摘要】第一部分NDV体外刺激对小鼠脾脏NK细胞TRAIL蛋白表达的影响目的：观察新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）体外刺激小鼠后脾脏NK细胞中TRAIL蛋白表达的变化。方法：用免疫磁珠法分离小鼠脾脏NK细胞，体外培养条件下用NDV给予刺激。RT-PCR检测NK细胞TRAILmRNA转录水平。Westernblotting检测NK细胞中TRAIL蛋白水平。流式细胞术检测NK细胞膜结合型TRAIL蛋白的表达率，ELISA检测NK细胞培养上清中可溶型TRAIL浓度。结果：NDV体外刺激可在mRNA和蛋白表达水平上上调NK细胞中TRAIL表达。结论：NDV体外刺激能够促进小鼠脾脏NK细胞产生TRAIL蛋白。第二部分NDV体外刺激促进NK细胞杀伤肝癌细胞株及其机制目的：观察NDV诱导的TRAIL表达上调能否增强NK细胞体外条件下对肝癌细胞株的杀伤作用，探讨NDV上调NK细胞TRAIL表达的机制。方法：用免疫磁珠法分离小鼠脾脏NK细胞，体外培养条件下用NDV给予刺激。用LDH法检测NK细胞对肝癌细胞株Hepa1-6和Novikoff的杀伤作用。用ELISA检测NK细胞培养基上清中IFN-γ和可溶型TRAIL蛋白浓度。用流式细胞术分析NK细胞表面膜结合型TRAIL蛋白表达水平。结果：NDV刺激可以增强NK细胞体外条件下对肝癌细胞株Hepa1-6和Novikoff的杀伤能力，并促进NK细胞产生IFN-γ。Anti-TRAIL中和抗体能够阻断NDV刺激后NK细胞对肝癌细胞株Novikoff的杀伤作用。Anti-IFN-γ中和抗体（6μg/ml）能下调NK细胞膜结合型和分泌型TRAIL蛋白表达水平，并降低NK细胞对肝癌细胞株Novikoff的杀伤效果。结论：NDV能够通过诱导IFN-γ的产生上调NK细胞TRAIL蛋白表达，从而增强NK细胞的体外抗肿瘤活性。第三部分腹腔注射NDV对小鼠外周血TRAIL水平及脾脏NK细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的影响目的：观察NDV注射对健康小鼠TRAIL蛋白表达和脾脏NK细胞抗肿瘤活性的影响。方法：健康BALB/c小鼠给予腹腔NDV注射，注射结束后12h用摘眼法收集外周血，采用ELISA法检测IFN-γ和TRAIL蛋白浓度。分离小鼠脾脏NK细胞，用RT-PCR法检测NK细胞内TRAILmRNA转录水平。用Westernblotting法检测脾脏NK细胞中TRAIL蛋白水平。用LDH法检测NK细胞对肝癌细胞株Novikoff的杀伤作用。结果：健康BALB/c小鼠腹腔注射NDV后，外周血IFN-γ浓度显著高于阴性对照组（P<0.01）。与阴性对照组相比，腹腔注射NDV能显著提高小鼠外周血TRAIL蛋白浓度（P<0.05）。NDV注射能够上调小鼠脾脏NK细胞TRAILmRNA和蛋白表达水平。不仅如此，腹腔注射NDV还能够增强小鼠脾脏NK细胞体外条件下对肝癌细胞株Novikoff的杀伤活性。单独使用anti-TRAIL中和抗体或联合使用anti-TNF-α和anti-FasL中和抗体后均能抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤（P<0.01）。但是，联合使用anti-TNF-α和anti-FasL中和抗体对NK细胞杀伤活性的抑制作用较单独使用anti-TRAIL时更强（P<0.01）。当三种中和抗体（anti-TRAIL、anti-TNF-α和anti-FasL）同时使用时，对NK细胞杀伤活性的抑制作用最为显著（P<0.01），最大抑制率可达78.2%。结论：腹腔注射NDV能够提高健康小鼠细胞TRAIL蛋白表达水平，并增强脾脏NK细胞在体外的抗肿瘤活性。但是NK细胞体外抗肿瘤活性的增加并非仅仅由TRAIL蛋白主导。第四部分NDV抑制小鼠H22移植瘤生长及其机制初探目的：观察NDV7793对小鼠H22肝癌移植瘤生长的抑制作用，初步探讨NDV体内抑制肿瘤生长的机制。方法：通过腋下接种H22肝癌腹水建立BALB/c小鼠移植瘤模型。给予荷瘤小鼠腹腔注射NDV。记录荷瘤小鼠肿瘤生长体积变化。种瘤后第28天用摘眼法收集荷瘤小鼠外周血，采用ELISA法检测IFN-γ和TRAIL蛋白浓度，采血后处死小鼠，剥取肿瘤组织，计算抑瘤率。分离荷瘤小鼠脾脏NK细胞，用RT-PCR法检测NK细胞TRAILmRNA转录水平。用Westernblotting法检测脾脏NK细胞中TRAIL蛋白水平。用LDH法检测NK细胞对肝癌细胞株Novikoff的杀伤作用。结果：BALB/c小鼠腋下接种H22肝癌腹水6天后形成实体瘤。给荷瘤小鼠注射NDV能降低移植瘤增长速度。荷瘤小鼠经NDV治疗后平均抑瘤率达52.6%，3只荷瘤小鼠（18.8%）的肿瘤体积较注射前缩小，其中1只（6.3%）移植瘤完全消褪。生存分析显示NDV组的荷瘤小鼠生存率显著高于阴性对照组（P<0.01）。NDV组的荷瘤小鼠外周血IFN-γ和TRAIL蛋白浓度显著高于阴性对照组（P<0.01）。与阴性对照组相比，腹腔注射NDV能提高荷瘤小鼠脾脏NK细胞TRAILmRNA和蛋白表达水平。NDV组的荷瘤小鼠脾脏NK细胞在体外条件下对肝癌细胞株Novikoff的杀伤作用显著高于阴性对照组。单独使用anti-TRAIL中和抗体或联合使用anti-TNF-α和anti-FasL中和抗体均不能有效抑制NDV组NK细胞对Novikoff的杀伤作用（P>0.05），只有同时使用anti-TRAIL、anti-TNF-α和anti-FasL三种中和抗体才能显著下调NK细胞对Novikoff的杀伤活性（P<0.01）。结论：荷瘤小鼠腹腔注射NDV能抑制移植瘤生长，显著上调小鼠细胞TRAIL蛋白水平，并通过包括TRAIL在内的多种途径增强脾脏NK细胞对肝癌细胞株的杀伤活性。
【作者】宋德志；
【导师】樊晓晖；
【作者基本信息】广西医科大学，病理与病理生理学，2014，博士
【关键词】NDV；NK细胞；TRAIL；肝癌；

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