miR-146a在胃癌中的作用及相关机制研究

miR-146a在胃癌中的作用及相关机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2016-01-26 分类:期刊论文 喜欢:3687
师大云端图书馆

【摘要】目的:研究microRNA-146a(miR-146a)在胃癌中的作用,并探讨与其作用相关的靶基因。方法:qRT-PCR检测60例胃癌组织和对应癌旁组织miR-146a的表达,分析其表达水平与临床病理参数的相关性;同时,qRT-PCR检测人胃癌细胞株MKN-45、SGC-7901、MGC-803和HGC-27miR-146a的表达情况。运用慢病毒颗粒过表达MKN-45和SGC-7901细胞中miR-146a水平,干扰MGC-803和HGC-27细胞中miR-146a的表达。CCK-8法和平板克隆形成实验观察miR-146a对胃癌细胞株增殖的影响;划痕愈合实验和铺或不铺Matrigel的transwell小室实验检测miR-146a对胃癌细胞株迁移、侵袭能力的作用;裸鼠尾静脉肺转移模型体内实验进一步验证miR-146a对胃癌转移能力的作用;利用靶基因预测软件并结合双荧光素酶报告基因系统探讨niR-146a与转移相关的靶基因;qRT-PCR法和Westernblot法检测miR-146a作用于靶基因的机制;在过表达miR-146a的胃癌细胞株基础上转染不含3’UTR的WASF2(上述验证的miR-146a与肿瘤转移相关的靶基因)编码区,在miR-146ainhibitor处理的胃癌细胞株基础上干扰WASF2,探讨miR-146a对胃癌的作用是否通过靶基因WASF2介导;免疫组化法检测60例胃癌组织和对应癌旁组织WASF2的表达,分析其表达水平与临床病理参数的相关性;分析60例胃癌组织中miR-146a与WASF2水平的相关性。结果:1.miR-146a在胃癌组织中表达下降。在本实验的60例胃癌及相应癌旁组织中,miR-146a的相对中位表达水平分别为0.162±0.019和0.823±0.072,P<0.01,差异具有明显统计学意义。2.miR-146a在胃癌中的表达水平与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移相关,miR-146a表达越低,胃癌患者的TNM分期越晚,P=0.018;miR-146a表达越高,胃癌患者发生淋巴结转移的几率越低,P<0.001。3.miR-146a在胃癌细胞系MKN-45和SGC-7901中表达较低,在MGC-803和HGC-27细胞中表达较高,过表达MKN-45和SGC-7901细胞中miR-146a水平,干扰MGC-803和HGC-27细胞中miR-146a的表达,用于后续的细胞生物学行为研究。4.CCK-8法检测细胞OD值结果显示:过表达和干扰miR-146a对胃癌细胞生长曲线无明显影响,差异无统计学意义;平板克隆形成实验结果显示:过表达和干扰miR-146a胃癌细胞克隆形成率无明显差异,miR-146a对胃癌细胞群体依赖性和增殖能力无影响。5.划痕愈合实验显示miR-146a可降低胃癌细胞的迁移能力,转染miR-146a的MKN-45和SGC-7901细胞24h后划痕仍有相当的距离,而对照组划痕有明显的变窄。不铺matrigel的tranwell小室实验结果显示,MKN-45和SGC-7901细胞miR-146a过表达组24h后Transwell小室每视野细胞数较对照组明显减少,P值分别为P=0.0037和P<0.0001;MGC-803和HGC-27细胞miR-146a干扰组24h后Transwell小室每视野细胞数较对照组明显增多,P值分别为P<0.0001和P=0.0039。进一步提示miR-146a可抑制胃癌细胞迁移能力。6.铺matrigel的tranwell小室实验结果表明,miR-146a可降低胃癌细胞的侵袭能力。MKN-45和SGC-7901细胞miR-146a过表达组24h后Transwell小室每视野细胞数较对照组明显减少,P值分别为P=0.0007和P<0.0001;MGC-803和HGC-27细胞miR-146a干扰组24h后Transwell小室每视野细胞数较对照组明显增多,P值分别为P=0.0045和P=0.0015。7.裸鼠尾静脉肺转移模型结果显示,荧光显微镜下miR-146a过表达组肺转移结节数目明显减少,全肺间断抽样切片20张每张切片平均肺转移病灶miR-146a过表达组和对照组分别为8士2vs20士3,P=0.0182。8.靶基因预测软件结合双荧光素酶报告基因系统结果验证了WASF2是miR-146a肿瘤转移相关靶基因,miR-146a降低WASF23’UTR克隆载体psiCHECK2相对荧光值达45%。9.qRT-PCR和Westernblot检测miR-146a过表达和干扰胃癌细胞株WASF2mRNA和蛋白水平结果表明,miR-146a作用于靶基因WASF2的机制是抑制其转录后翻译。10.回补实验结果显示,过表达WASF2可逆转miR-146a对MKN-45细胞迁移侵袭能力的抑制作用;反之,干扰WASF2表达可逆转miR-146ainhibitor促MKN-45细胞迁移侵袭能力。11.免疫组化检测60例胃癌及相应癌旁组织WASF2水平表明,WASF2在胃癌组织中高表达,癌组织和癌旁组织表达差异具统计学意义,P<0.001;且胃癌组织WASF2的表达水平与胃癌患者淋巴结转移相关,WASF2表达越高,胃癌患者发生淋巴结转移的几率越高,P=0.013。12.分析胃癌组织中miR-146a与WASF2水平相关性结果显示,WASF2低表达组miR-146a中位水平为0.227±0.035;WASF2高表达组miR-146a中位水平为0.118±0.017,胃癌组织中miR-146a表达水平与WASF2水平负相关,P=0.0309。结论:miR-146a在胃癌组织中表达下降,其低表达与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移相关;miR-146a在胃癌组织中行使抑癌基因的作用,抑制胃癌的侵袭转移能力;miR-146a抑制胃癌侵袭转移能力的机制是下调靶基因WASF2的表达,促进胃癌细胞长条形运动。miR-146a/WASF2调控机制的发现揭示了胃癌转移的一个新机制并为治疗胃癌提供了一个新的潜在靶点。
【作者】姚群燕;
【导师】张顺财;
【作者基本信息】复旦大学,消化内科学,2013,博士
【关键词】miR-146a;胃癌;肿瘤转移;靶基因;WASF2;

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