玉郎伞多糖抗衰老作用及机制研究

【摘要】衰老(Aging)是一种自然现象，衰老是机体分子、细胞、器官功能乃至整个功能衰退的综合复杂的生理、病理变化过程是老年期变化的简称。衰老是任何生命过程的必然规律,不能抗拒,但是能够延缓。随着国际人口老龄化趋势的加快,探讨衰老机理及抗衰老研究已成为医学领域中的热门课题之一。衰老是从生殖成熟后才开始或加速的,它是具有累积性、普遍性、渐进性和内生性的生命过程，是所有生物的共同特征。机体要经过生长发育期、生殖期、衰老期的生命过程,不同物种在寿限决定上有相似机制。其退行性变化在生物个体的生命周期中必然发生并且是难以逆转的。衰老是多因素协同引起的生命渐趋弱化的过程，并非单因素所致的现象,所以关于衰老机制的研究是长期困扰国内外学者的难题之一。目前解释衰老机制的理论或学说不下300种,如神经内分泌学说、交联学说、遗传学说、损伤学说、差错灾难学说、自由基学说、代谢学说等，分别从不同的角度探讨了衰老发生的机制和对策。在这些衰老学说，其中以自由基学说最受重视。自由基对蛋白质和核酸的影响涉及面很广,后果严重而复杂。大量实验研究证明减少体内自由基产生、抑制炎症反应能防治衰老性疾病。根据老化的自由基理论,老化过程被认为是导致氧化失衡损伤及抗氧、因此，它一直认为通过防止氧化损伤的抗氧化防御地位的提升可能会抵消衰老和年龄相关性疾病，如癌症、心血管疾病、和一些神经退行性疾病。通过的衰减延缓老化过程诱导的ROS(reactiveoxygenspecies)过度氧化应激，具有抗老化剂作用而备受关注。而近年来研究表明衰老作为一种正常而复杂的生命过程,涉及机体的不同组织、细胞的一系列特定程序性变化。众多研究表明，细胞衰老作为衰老的基本过程是借助于信号传导途径实现的,许多细胞因子亦参与到这些信号途径中。其中最经典的细胞衰老途径为p16INK4a-Rb和p53-p21WAF1/CIP1-Rb途径。目前已发现这两条衰老途径中p16或p21过高表达均可使衰老细胞中活性氧自由基ROS水平上升和积聚而诱导衰老。玉郎伞[MillettiapulchraKurzvarlaxior(Dunn)Z．Wei,YLS],是广西壮族的民间习用药材，主要分布于广西、广东等地，具有补气、补血、补虚润肺之功能，民间用于治经常性消化不良、干瘦、病后虚弱、智力低下、疗营养不良、产后虚弱、腰腿痛、风湿痛和慢性肝炎，也用于智力减退、可强身健体、消除疲劳,主要用于老年健忘、亦用于体弱多病及病后、产后虚弱等的滋补,小儿智力低下等疾病的治疗,提高免疫力及改善大脑记忆等功效。玉郎伞多糖[MillettiapulchraKurzvarlaxior(Dunn)Z．Wreipolysaccharides，YLSPS]为其主要有效成分，是从玉郎伞中提取的主要有效成分之一。前期研究表明YLSPS具有较强的清除羟自由基和氧自由基作用，对肉瘤荷瘤小鼠有明显的抗肿瘤作用，对小鼠免疫功能的调节作用，对慢性应激抑郁小鼠行为学及海马结构的影响等。YLSPS的抗衰老作用目前未见国内外相关文献报道。目的在本研究中，我们采用D-半乳糖致衰老的小鼠模型来研究YLSPS抗衰老的可能机制，然后（1）通过检测血清、肝和脑组织SOD、GSHPx、CAT、T-AOC的活性以及肝、脑组织衰老病理变化；（2）考察YLSPS对D-半乳糖衰老模型小鼠免疫功能及血清中晚期糖基化终末产物（AGEs）含量的影响；（3）YLSPS对D-半乳糖致衰老小鼠记忆行为的改善作用；（4）以细胞衰老信号转导途径p53-p21和p16中涉及的关键调节因子着手,从分子生物学角度探讨YLSPS抗机体衰老的作用机制。方法1.实验动物、分组及模型建立：将60只昆明小鼠（18-22g）随机分为6组，即:正常组（Control）、D-半乳糖组（D-gal）、YLSPS高剂量组（YLSPS-H，600mg/kg）、YLSPS中剂量组（YLSPS-M，300mg/kg），YLSPS低剂量组（YLSPS-L，150mg/kg）和阳性对照维生素E组（VE，200mg/kg），每组10只。用D-半乳糖（D-gal，200mg/kg）溶液颈背部注射方法建立衰老模型。阳性药组和给药组在颈背部注射D-半乳糖溶液同时灌胃给维生素E、YLSPS客剂量，连续用药8周。2.标本的采集及研究方法：2.1连续用药8周后，取各组小鼠的血清、肝组织、脑组织，采用可见分光光度法检测血清、肝、脑组织中SOD、GSHPx、CAT、T-AOC活性和MDA活力，同时取各组小鼠肝、脑组织用甲醛溶液固定，制作石蜡组织切片，进行HE染色光镜下观察肝、脑组织病理结构的变化。2.2按胸腺重量/体重、脾重/体重计算胸腺指数和脾脏指数。应用ELISA法检测血清中IL2，IL6，AGEs的含量。2.3应用Morris水迷宫考察空间学习记忆能力。免疫组化法检测脑组织BDNF和ChAT蛋白的表达。2.4应用RT-PCR法检测肝、脑组织p16，p21的基因水平。2.5Westernblotting方法检测肝、脑组织p53，p21蛋白的表达。结果1.YLSPS对D-半乳糖致衰老小鼠氧化损伤的保护作用1.1YLSPS对D-半乳糖致衰老小鼠组织抗氧化的作用D-半乳糖组小鼠血清、脑和肝组织SOD、GSHPx、T-AOC、CAT活性明显降低，与空白组比较有显著性差异，YLSPS各剂量组均能提高血清、脑和肝组织中上述指标数值。1.2YLSPS对D-半乳糖致衰老小鼠肝，脑组织病理学影响的作用整体解剖学改变情况：Control组小鼠肝脏表面光滑，颜色棕红，质软而脆，外观未见异常。D-半乳糖组小鼠肝脏表面可见白色坏死点。YLSPS各剂量组较D-半乳糖组肝脏颜色较红，外观基本正常；光镜观察，Control组肝细胞镜下结构正常，肝索排列规律，肝窦正常，中央静脉无异常。D-半乳糖组肝细胞体积缩小，核亦缩小部分肝细胞连接松散，肝窦明显扩张，肝索狭窄。YLSPS-H组肝细胞及细胞核结构，大小、肝窦、肝索结构未见明显异常。YLSPS-M和YLSPS-L组肝细胞增大，部分肝细胞可见双核，肝索及肝窦未见明显异常。对衰老模型D-半乳糖小鼠海马CA1区细胞形态学的影响组织石蜡切片经HE染色后,光学显微镜下正常细胞核呈均一淡蓝色或蓝色，胞质呈淡红色，胞膜完整连续。异常组织则细胞变圆变小,胞核固缩、碎裂，出现局部深染,不均匀或者核分散消失而不见核染色。Control组海马区细胞排列整齐，层次紧密，形态完整，细胞边缘清晰，染色均匀,核仁深染；D-gal组细胞数量较少,细胞间隙增长,排列疏松不齐,大部分细胞核仁浅染,染色质不均匀,少量神经细胞的圆形胞核体积减小,固缩,有的甚至消失、核膜皱缩；YLSPS组与正常对照组和模型组相比，细胞数量增多,大部分细胞形态完整，细胞边缘清晰，染色质均匀，核仁深染。YLSPS组与模型组相比，细胞数量增多，但与正常组相比，细胞数目有所减少，大部分细胞排列整齐，层次紧密，核仁深染。2.YLSPS对D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能及AGEs含量影响作用。2.1YLSPS各剂量组、维生素E组的胸腺指数与D-gal组比较、脾脏指数明显升高，差异有统计学意义。2.2D-半乳糖组与Control组比较,血清中IL-2浓度明显降低；与D-半乳糖组比较,维生素E组、YLSPS各剂量组IL-2浓度有所增加,均有显著性差异。2.3D-半乳糖组与Control组比较,血清中IL-6浓度明显增加；与D-半乳糖组比较,维生素E组、YLSPS各剂量组IL-6浓度有所降低。2.4D-半乳糖组与Control组比较,血清中AGEs浓度明显增加；与D-半乳糖组比较,维生素E组、YLSPS各剂量组AGEs浓度有所降低。3.YLSPS对D-半乳糖致衰老小鼠记忆行为的改善作用3.1YLSPS对学习记忆的影响利用Morris水迷宫，考察YLSPS对D-半乳糖衰老模型小鼠被动学习记忆和空间认知能力的影响.结果发现D-半乳糖致衰老小鼠的被动学习记忆和空间认知能力下降，用YLSPS治疗8周后，明显改善衰老小鼠的学习记忆能力。通过各组与模型组第五天潜伏期比较可知：Control组与D-gal组比较，其潜伏期有显著的差异。YLSPS组和维生素E治疗组与D-gal组比较，其逃避潜伏期也有显著的差异。提示YLSPS和维生素E对D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆能力有改善作用。3.2YLSPS对D-半乳糖衰老小鼠乙酰胆碱转移酶（ChAT）和脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响。通过免疫组织化学染色发现D-半乳糖致衰老模型小鼠海马脑脑组织ChAT和BDNF阳性表达细胞与正常对照组相比显著减少(p<0.01)。用YLSPS和维生素E治疗后，ChAT和BDNF阳性表达细胞较模型组明显增多(p<0.01或p<0.05)。实验结果说明YLSPS通过提高D-半乳糖致衰老模型小鼠大脑海马的ChAT和BDNF阳性细胞表达量,提高小鼠学习记忆能力。4.YLSPS-H对D-半乳糖致衰老小鼠p16,p21基因影响qRT-PCR结果表明，D-半乳糖组肝,脑组织p16,p21基因表达与正常组比较升高，差异有显著性；维生素E组、YLSPS-H组与D-半乳糖组比较均降低，差异有显著性。说明YLSPS-H能降低衰老小鼠肝,脑组织p16,p21基因的表达。5.YLSPS-H对D-半乳糖致衰老小鼠p53,p21蛋白影响。Westernbloting结果表明D-半乳糖组肝，脑组织p53,p21表达与正常相比升高(P<0.01),YLSPS-H组与D-半乳糖组比较降低（p<0.05）。维生素E组肝,脑组织p53,p21蛋白表达与D-半乳糖组比较表达降低(p<0.01）。表明YLSPS-H有降低衰老小鼠肝,脑组织p53,p21表达的作用。结论1.YLSPS对D-半乳糖致衰老小鼠氧化损伤的保护作用和减缓衰老组织结构的损伤可能通过：增加抗氧化酶活性，除去过量的氧自由基，并减少或阻止细胞和组织的破坏，从而保护细胞和组织的正常功能和延缓诱导D-半乳糖老化过程。2.YLSPS可能提高免疫功能通过升高胸腺指数,脾脏指数,血清中IL-2含量,和降低血清中IL-6的含量。3.YLSPS可能改善记忆功能的作用通过提高脑组织ChAT和BDNF阳性表达。4.YLSPS在细胞水平上具有延缓衰老的作用通过调整细胞衰老基因。具体是下调p16,p21基因表达，并降低p53,p21蛋白表达。
【作者】段文明（DOANVANMINH）；
【导师】黄仁彬；
【作者基本信息】广西医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】玉郎伞多糖；D-半乳；衰老；抗衰老；抗氧化作用；

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