FPV JL09C2株中REV插入区基因的表达验证及单抗制备

【摘要】鸡痘是由鸡痘病毒（Fowlpoxvirus，FPV）引起的一种接触性传染病，广泛发生于鸡和火鸡，临床上主要分为皮肤型、黏膜型和混合型三种。皮肤型鸡痘特征性病变表现为局灶性上皮组织增生；黏膜型又称“白喉型”，以口腔和咽喉黏膜发生纤维素性坏死性炎症为主要特征，由于该型病鸡常发生窒息死亡而导致此病变在临床上不常见；混合型则兼有以上两种类型的病理变化。FPV感染可引起母鸡产蛋量下降、育肥鸡生长迟缓，甚至出现继发感染而导致病鸡死亡，因此该病的发生对世界养禽业造成严重的经济损失。近半个世纪以来，在鸡痘流行区域，主要使用鸡痘和鸽痘病毒疫苗进行免疫预防，虽然因普遍采用疫苗免疫接种使鸡痘疫情报道明显减少，但由于病毒变异而导致免疫失败引发鸡痘的病例时有发生。近年来，在我国的FPV疫苗毒和野毒株中不断有REV的污染和基因整合的报道，REV基因片段甚至完整的基因组整合在FPV基因组中的现象比较普遍。2009年，本实验室从吉林省公主岭市某爆发鸡痘的大型鸡场中分离到了一株高致病性鸡痘病毒，通过鸡胚进行克隆纯化，并将其命名为FPVJL09C2。对FPVJL09C2株进行全基因组测序发现，其基因组中整合了接近全长禽网状内皮组织增生病病毒（REV）的基因片段，仅在两端LTR分别缺失了29bp和322bp大小的片段。有关REV整合入FPV基因组现象只有在两种病毒同时感染宿主的情况下才能发生，且这种重组的频率较低，但是在前期研究中我们在没有外来选择压力的情况下即分离获得了FPV重组病毒而且其能在鸡胚上形成明显的痘斑，这表明该整合方式能够促进病毒的复制。我们推测主要是由于以下两方面原因：（1）REV的插入导致FPV基因发生改变；（2）插入的REV基因能够抑制宿主免疫系统以利于FPV复制。为了证实上述设想，本研究原核表达获得REVgag和gp90蛋白，以此作为抗原，利用ELISA、Westernblot等免疫学方法对该重组鸡痘病毒自然状态下感染宿主后REV基因片段的表达情况进行验证分析，结果显示，在FPVJL09C2毒株感染鸡血清中检测出REVgag和gp90蛋白的抗体；通过构建了REVgag、env和FPVORF202真核表达载体，转染细胞后进行间接免疫荧光检测，也检测出REVgag和gp90蛋白的抗体，但没有检测到FPVORF202的抗体。上述结果表明，尽管REV基因组两端有缺失，但并不影响gag、env基因的表达。然而，利用制备的REVgag和gp90蛋白多抗检测不到重组病毒中的REVgag和gp90蛋白，该结果表明REVgag和gp90蛋白虽然能够表达但并未整合入鸡痘病毒中。此外，本实验成功制备出针对REVgp90的单克隆抗体，将为临床上REV重组鸡痘病毒免疫学检测方法及其致病机制的研究奠定基础。
【作者】潘伟；
【导师】宋德光；
【作者基本信息】吉林大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】鸡痘病毒；禽网状内皮组织增生病病毒；单克隆抗体；蛋白表达；重组病毒；

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