PolyI:C诱导小鼠蜕膜基质细胞坏死性凋亡及其分子机制

【摘要】妊娠期间病原感染是导致流产、早产、死产等妊娠疾病的重要诱因，病原感染不仅影响胎儿的存活，还能威胁母体的健康和生命。已知多种病毒如巨细胞病毒、风疹病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等均严重损害正常妊娠进程，但人们对于病毒感染导致妊娠失败的机制仍不十分清楚。病原微生物的自身组分或分泌产物是其重要致病因子，这些组分或分子结构可被多种病原微物所共有，结构恒定进化保守，被称之为病原相关分子模式（PAMP）。PAMP被相应的模式识别受体（PRR）所识别，启动机体免疫反应。病原PAMP通常诱导过度炎性反应，从而促进病原的感染性和致病力，导致机体损伤或宿主死亡。核酸作为一种PAMP，是病毒的主要致病因子。病毒核酸有多种形式包括单、双链RNA（ssRNA,dsRNA）和单、双链DNA（ssDNA,dsDNA）。妊娠期受多种dsRNA病毒的感染，因此，阐明dsRNA对妊娠结局的影响及致病机制是有效防治dsRNA病毒妊娠感染的前提和基础。母-胎界面结构和功能完整是妊娠维持的必要条件，妊娠期感染病原通常侵袭母-胎界面细胞。蜕膜基质细胞构成母-胎界面的主要细胞，其功能正常对于妊娠维持起重要的作用。胎盘和胎儿病原感染主要经由两条途径：一是经子宫上行感染，二是经由母体血液循环感染，两种感染途径来源的病原微生物均能直接作用于蜕膜基质细胞。细胞对刺激或感染的免疫反应，除了细胞因子释放外，还有一种重要的应答方式，即细胞死亡。病原通过诱导被感染细胞的过度死亡，能破坏组织结构完整性，增强感染力和致病力。坏死性凋亡（Necroptosis）是近年来细胞死亡机制研究领域中的前沿热点之一。坏死性凋亡是可调控的细胞坏死，依赖于RIPK1/RIPK3激酶活性，越来越多的研究表明坏死性凋亡在多种疾病发生中起重要作用。本文基于上述理论提出如下假设，病毒妊娠感染导致不良妊娠结局的可能机制是：病毒侵袭胎盘后，其病原相关分子模式如核酸dsRNA作用于蜕膜基质细胞，促进蜕膜基质细胞的死亡和炎性细胞因子分泌，破坏胎盘组织结构完整和妊娠免疫平衡，从而终止妊娠进程。本文首先建立小鼠蜕膜基质细胞的分离和体外培养方法。应用外源polyI:C转染蜕膜基质细胞，MTT和FACS分析表明polyI:C转染明显促进细胞死亡，并呈现明显的剂量依赖形式。并且，polyI:C转染也能促PARP和Caspase3蛋白的剪切，进而证明polyI:C细胞死亡诱导效应。为了揭示其诱导细胞死亡的方式，进而应用RIPK1抑制剂necrostatin-1（nec-1）、MLKL抑制剂Necrosulfonamide（NSA）、Caspase泛抑制剂z-VAD-Fmk，单因素或多因素联合polyI:C转染进行细胞死亡分析，结果表明polyI:C转染能明显促进小鼠蜕膜基质细胞的坏死性凋亡，并且诱导坏死性凋亡并不依赖于Caspase的抑制。电镜进行形态学分析进一步确证了polyI:C转染诱导蜕膜基质细胞死亡方式为坏死性凋亡。为了分析polyI:C诱导细胞死亡的信号机制，主要借助于RNAi技术和基因敲除小鼠进行分析，结果表明，polyI:C转染诱导蜕膜基质细胞坏死性凋亡的发生依赖于MDA5-Mavs信号，而不依赖于TLR3-TRIF信号。转染的polyI:C激活胞质中的MDA5-Mavs识别信号，TLR3-TRIF识别信号主要位于内体，因此本文进而应用外源性polyI:C非转染方式处理蜕膜基质细胞，分析其细胞死亡诱导效应。实验结果表明非转染方式的polyI:C诱导细胞死亡效应不明显，仅在较高浓度下才表现轻度诱导效应，但是联合Caspase泛抑制剂z-VAD-Fmk后，低浓度polyI:C就能显著诱导细胞死亡，并且这种细胞死亡能被RIPK1抑制剂necrostatin-1逆转，却不能被MLKL抑制剂NSA逆转，说明非转染方式的polyI:C诱导蜕膜基质细胞的坏死性凋亡主要依赖于RIPK1信号，而不依赖于MLKL信号。应用TRIFKO小鼠来源的蜕膜基质细胞分析表明，非转染方式的polyI:C诱导的坏死性凋亡依赖于TLR3-TRIF信号。综上所述，本课题证明了外源性polyI:C通过内体TLR3-TRIF信号途径和胞质中MDA5-MAVS信号途径，诱导蜕膜基质细胞坏死性凋亡的发生，一定程度上揭示了双链RNA或病毒感染影响妊娠结局的新机制，从而为妊娠感染的预防和治疗提供了理论依据。
【作者】姜贵梅；
【导师】杨勇军；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】蜕膜基质细胞；双链RNA；坏死性凋亡；TLR3-TRIF信号通路；MDA5-Mavs信号通路；妊娠结局；

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