两种真菌免疫调节蛋白基因的克隆以及在毕赤酵母GS115中的重组表达

【摘要】真菌免疫调节蛋白家族(FIPs)是近年来从大型真菌中提取的具有免疫活性的一类小分子量蛋白,与植物凝集素和免疫球蛋白的结构和免疫功能类似。迄今为止,分别在赤灵芝(Ganodermalucidium),松杉灵芝(Ganodermatsugae),小孢子灵芝(Ganodermamicrosporum),紫芝(Ganodermajaponcium),金针菇(Flammulinavelutipes),草菇(Volvariellavolvacea),甜芝(Ganodermasinense)、血红丛赤壳(Nectriahaematococca)、黑灵芝(Ganodermaastum)和樟芝(Antrodiacamphorata)中发现了真菌免疫调节蛋白,即LZ-8、FIP-gts、FIP-gmi、FIP-gja、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gsi、FIP-nha、FIP-gas、FIP-aca。这些不同的真菌免疫调节蛋白在体内外均具有免疫调节和抗肿瘤等多种生物学活性,主要表现在促淋巴细胞增殖,诱导多种细胞因子的分泌,引发细胞自噬等。本论文主要分为两部分。一部分是金针菇免疫调节蛋白基因诱导型和组成型表达以及生物学活性测定。探究为获得稳定来源并且具有生物学活性的金针菇免疫调节蛋白的最佳表达方式和条件,我们从金针菇子实体中克隆出金针菇免疫调节蛋白基因(FIP-fve),构建了金针菇诱导型表达载体pPIC9-FIP-fve。从毕赤酵母基因组DNA中克隆出三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PGAP基因,构建了金针菇组成型表达载体pPIC9-PGAP-FIP-fve。分别将两种线性化的表达载体转入毕赤酵母GS115中,经菌落PCR鉴定筛选正确的酵母转化子。将酵母转化子进行以甲醇为碳源的诱导型发酵培养和以葡萄糖、甘油为碳源的组成型发酵培养。在诱导型发酵过程中,重组蛋白在第4天的表达量最高,达到158.2mg/L。在组成型发酵过程中,以葡萄糖(10%)为碳源的表达,在第4天表达量最高,达到46.3mg/L；以甘油(1%,V/V)为碳源的表达,在第5天表达量最高,达到29.5mg/L。Westernblot结果证实了重组表达的蛋白是正确表达的目的蛋白。重组蛋白经过硫酸铵沉淀和SephadexG100凝胶柱层析纯化后,进行了一系列生物活性的检测。结果表明重组蛋白具有和天然FIP-fve类似的血细胞凝集、促脾淋巴细胞增殖和诱导脾淋巴细胞分泌IL-2的功能。本论文的另一部分是云芝免疫调节蛋白基因的克隆和重组表达。为了验证真菌免疫调节蛋白在云芝中的存在性,我们以云芝菌丝体为材料,提取云芝菌丝体的基因组DNA,采用PCR和染色体步移技术成功克隆了编码云芝免疫调节蛋白的基因(暂命名为FIP-cve),发现FIP-cve分别与树舌免疫调节蛋白和灵芝免疫调节蛋白有99%和86%的同源性。构建了表达载体pPIC9-FIP-cve。将pPIC9-FIP-cve转化至毕赤酵母GS115中,经菌落PCR鉴定筛选正确的酵母转化子。将重组的酵母菌进行以甲醇为碳源的诱导培养,经过SDS-PAGE检测证明FIP-cve在毕赤酵母GS115中成功表达。为进一步研究重组FIP-cve奠定基础。
【作者】贾佳；
【导师】林景卫；
【作者基本信息】沈阳农业大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】金针菇免疫调节蛋白；云芝免疫调节蛋白；毕赤酵母GS115；重组表达；

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