表达β-内啡肽的重组腺病毒（Ad-NEP）治疗大鼠骨癌痛的实验研究

【摘要】研究背景和目的慢性疼痛是目前最常见也是最缺乏有效治疗手段的疾病。对于那些晚期癌痛患者，疼痛往往成为他们生命最后阶段最为痛苦的经历。有研究显示约有三分之二的晚期癌痛患者会发生骨转移，骨转移也被认为是癌症引起疼痛最为常见的原因，肿瘤细胞的不断浸润，正常的骨质结构遭到破坏，其结果是受侵犯骨在轻度受力的情况下即会出现剧烈的疼痛反应，这是影响晚期肿瘤患者生存质量的主要原因之一。有效的止痛治疗已成为目前亟待解决的问题。静脉或口服阿片类药物是缓解疼痛的有效方法，但又带来诸多副作用，如过度镇静、呼吸抑制、便秘以及成瘾等。病人自控镇痛技术的出现，给癌痛患者带来了福音，但同样存在难以长期维持、增加感染机会、费用较高等问题。寻找更方便、有效、作用持久且经济、安全的镇痛方法，成为人们关注的热点。近年来，用基因治疗的方法来处理慢性疼痛，利用外源性载体介导内源性蛋白直接或间接作用于外周和中枢神经元，有着比化学药物或蛋白制剂纯度高、副作用少、耐受发生率低，且可利用载体表达的特异性和长期性等优势，解决了临床上长期用药带来的问题。目前，有研究表明使用表达-内啡肽的重组腺病毒（Ad-NEP）对CCI大鼠模型的疼痛治疗有着积极的意义。那么，如果使用Ad-NEP对骨癌痛大鼠进行疼痛治疗，是否也有积极的效果呢？本实验拟构建携带-内啡肽的重组腺病毒，并通过侧脑室注射接种，转染宿主室管膜细胞，长期高效地表达-内啡肽，升高脑脊液中-内啡肽的含量，经由脑脊液循环直接作用于脊髓节段μ型阿片受体（MOR）。通过G蛋白介导的信号传导通路抑制神经元从c-fos和c-jun基因的表达，从而抑制伤害性信号的上传，增强抑制性调制系统的功能，改变神经元的可塑性来提高痛阈。本研究试图尝试慢性癌痛病人的长期治疗的新途径，为进一步研究腺病毒在中枢神经系统内的转染效率及其安全性提供实验依据。方法1.大鼠胫骨癌痛模型的建立和可行性评估将实验大鼠分为肿瘤组，假手术组，和正常组三组。预先将Walker256大鼠乳腺癌细胞接种于刚断奶的幼鼠腹腔中，于种植的第7天抽取幼鼠含有肿瘤细胞的腹水，分离提取，而后将此腹水混合液注入肿瘤组实验大鼠右侧胫骨。假手术组注入灭活的腹水混合液，正常组大鼠不做处理。接种术后当天、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22天，每天同样的时间点，将三组实验大鼠进行大鼠正常走动痛行为学评分（Thescoreofambulatorypain），辐射热刺激测痛以及机械撤爪阈值（vonFrey阈值）的行为学测定。各组大鼠于接种后第22天，于麻醉后，对其双下肢进行CT扫描。CT扫描条件：80KV，50MA，矩阵512×512，层厚0.7mm。观察右侧胫骨骨质有无发生变化。以上实验遵从随机双盲原则。2.大鼠侧脑室注射表达β-内啡肽的重组腺病毒（Ad-NEP）对脑脊液β-内啡肽浓度的影响。我们使用病毒滴度为5×1011PFU的非增殖型第一代基因重组腺病毒Ad-NEP，分别制备5×1010PFU、5×109PFU、5×108PFU、5×107PFU四种不同滴度容积为30l的待用病毒溶液。将实验SD大鼠分为6组，其中A组，B组，C组，D组，E组分别对应5×107PFU，5×108PFU，5×109PFU，5×1010PFU，5×1011PFU五种不同滴度的Ad-NEP，F组为生理盐水对照组。对应组别将五种不同滴度的Ad-NEP分别注入相应组别健康正常大鼠侧脑室，在注射后第4天采集大鼠脑脊液并测定其中-EP浓度。同时，F组于对应时间注射生理盐水进行对照。统计分析各个不同浓度组以及正常对照组的大鼠脑脊液-EP浓度值，将病毒滴度对数值与脑脊液-EP浓度值作相关性分析，推定适合大鼠侧脑室注射的病毒滴度并讨论表达物与所注射病毒滴度的相关性。3.腺病毒Ad-NEP侧脑室注射后对于骨癌痛大鼠疼痛的影响。根据第二部分实验结果制备滴度为5×109PFU的Ad-NEP。根据第一部分实验结果使用walker256大鼠乳腺癌细胞建立大鼠胫骨癌痛模型。实验大鼠随机分为Ad-NEP组（A组），对照组（B组）和正常组（C组）。前两组实验动物均按照第一部分实验方法复制大鼠胫骨癌痛模型。而后在接种第10天Ad-NEP组大鼠侧脑室注射5×109PFU的Ad-NEP，对照组注射等容量的生理盐水。正常组大鼠不做任何处理。同时在接种含有肿瘤细胞的腹水手术后的当天、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22天，每天同样的时间点，将三组实验大鼠进行测量体重，正常走动痛行为学评分（Thescoreofambulatorypain），辐射热刺激测痛以及机械撤爪阈值（vonFrey阈值）的行为学测定。此外，以侧脑室注射日为0天，在侧脑室注射Ad-NEP后的第2，4，8，12天，分别在当日行为学评估之后进行三组实验大鼠脑脊液的抽取，并使用放射免疫分析法（RadialImmunoassay，RIA）测定脑脊液标本中-EP浓度。Ad-NEP组实验大鼠于接种后22天也就是侧脑室注射后第12天，在进行行为学测定以及脑脊液抽取后进行脑组织的取材。取材之后标本进行切片，并荧光染色。以上实验遵从随机双盲原则。结果1.肿瘤组有两只大鼠在术后第7天出现不可预见的死亡。假手术组自术后第二天其饮水进食均正常，无出现死亡。在手术第1周，肿瘤组的体重和其他两组无明显区别，第2周开始肿瘤组体重增长慢于其他两组，到第3周差距更加明显。术后第6天始，肿瘤组15只大鼠中2只评分为3分。术后第18天，肿瘤组所有大鼠正常走动痛行为学评分均为1分。假手术组和正常组大鼠术后第2天开始观察，步态正常，评分均为4分。对于大鼠辐射热刺激测痛的行为学评估，通过测试，我们发现各组热痛觉过敏潜伏期差异均无统计学意义。对于大鼠机械撤爪阈值（vonFrey阈值）的行为学测定，测试发现肿瘤组在行走痛行为学评分较高的早期，接种侧后肢和对侧后肢相比无统计学改变，但当出现患侧后足明显不负重时，此时会出现2-3天的机械痛超敏期。同一只大鼠在接种后的早期，测得一稳定的和基础值相近的痛阈值。当出现痛敏时，同样条件测到的痛阈值和前者有明显统计学差异（P<0.01）。除此以外，机械性诱发痛觉超敏时期患侧和对侧的痛阈值也有明显的统计学差异（P<0.05）。大鼠影像学结果，接种手术后第22天，肿瘤组有两只大鼠CT扫面见肿瘤并未侵蚀右侧胫骨，后行解剖发现肿瘤侵蚀右侧胫骨外组织直至皮下。其余肿瘤组大鼠CT扫面均可见右侧胫骨上段干骺端骨皮质变薄，虫蚀状改变，透光性增加。假手术组及正常组均未发现有肿瘤侵蚀。2.E组实验大鼠在侧脑室注射后陆续全部死亡。其余4个实验组无实验大鼠死亡，并且这4个实验组组间数据均有显著统计学差异（P﹤0.01）。其中A、B组与正常对照组（F组）数据无显著统计学差异（P＞0.05）；C、D组与正常对照组（F组）相比均有显著差异（P﹤0.01）。3.各组大鼠接种手术一周内的体重无明显区别，但从第二周开始A组B组体重增长慢于C组，到第三周，其差距更加明显，侧脑室注射后发现A，B两组大鼠体重增长明显慢于正常组，并且A，B两组间体重增长无明显区别（P>0.05）。对于大鼠正常走动痛行为学评分，A组于第10天侧脑室注射Ad-NEP后，于第12天起疼痛行为评分下降趋势明显小于B组（P<0.05）。大鼠机械撤爪阈值（vonFrey阈值）的行为学测定，我们发现从接种第12天起，也就是侧脑室注射后第2天开始，不管是患侧还是患肢对侧，A组大鼠的痛阈相对于B组大鼠均有了显著提高（P<0.01）。这种显著性差异患侧一直持续到接种手术后第20天，患肢对侧持续至第18天才消失。放射免疫分析法测定脑脊液标本中-EP浓度的结果显示，在侧脑室注射5×109PFU滴度的Ad-NEP后第4天起A组大鼠的脑脊液-EP浓度大幅度提高。病毒注射组大鼠侧脑室注射后第4天的大脑组织免疫荧光照片显示，侧脑室注射后，A组大鼠侧脑室周边致密分布着Ad-NEP的表达产物-EP。结论1.利用Walker256大鼠乳腺癌细胞可以成功构建大鼠胫骨癌痛模型，并且易于复制。2.容积30l，滴度5×109、5×1010PFU的重组腺病毒Ad-NEP是比较适合大鼠侧脑室注射的病毒条件。此剂量可以使实验大鼠脑脊液获得高浓度-EP，同时也不会在实验中造成实验大鼠大量死亡。3.将容积30l，滴度5×109PFU的重组腺病毒Ad-NEP对Walker256大鼠乳腺癌细胞构建的大鼠胫骨癌痛模型进行侧脑室注射，可以有效减轻骨癌痛大鼠的痛觉敏化，提高机械性刺激的痛阈，大大增加脑中-内啡肽的浓度，从而改善骨癌痛大鼠的生存效果。
【作者】张中军；
【导师】杨建平；
【作者基本信息】苏州大学，麻醉学（专业学位），2014，博士
【关键词】β-内啡肽；腺病毒；基因治疗；Ad-NEP；癌性疼痛；侧脑室注射；

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