microRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中的表达谱研究

【摘要】第一部分悬浮培养法分离人胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞目的：探讨悬浮培养法在胃癌细胞株MKN-45中分离胃癌干细胞的可行性，为研究胃癌干细胞建立一种细胞模型。方法：人胃癌细胞株MKN45购自中科院上海细胞库。MKN45细胞复苏以后在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液中培养，细胞贴壁以后，收集贴壁细胞置于含无血清的RPMI-1640培养液96孔超低粘附板(Corning)中培养，培养液中加入1%N-2添加剂，2%B-27添加剂(Invitrogen),1%青链霉素(Gibco),20ng/ml人FGF-2和100ng/mlEGF(Chemicon)，观察的肿瘤球形成情况，每孔100个细胞，两周后在倒置显微镜(Olympus)下放大40及100倍观察肿瘤球形成情况。当形成的克隆球长到200-500个细胞时，将肿瘤球溶解成1000个/ml细胞的溶液，按每孔100μL单细胞悬液植入含无血清培养液的96孔的超低粘附板(Corning)中，两周后观察第二代肿瘤球就形成情况，贴壁细胞作为对照组观察成球情况。重复上述步骤，亚代球体细胞体外传代培养六代以上。结果：胃癌MKN-45细胞在无血清培养基中能形成悬浮球状体。悬浮培养7d即开始形成细胞球体，培养至14d球体基本形成，中心密度増高。培养21d左右球体完全形成，球体结构饱满，细胞排列致密，中心密度更高。第一代球体细胞吹散后在无血清培养基中继续培养，能继续形成细胞球体，随着传代代数的增加，成球率逐渐增高，传代至第六代时，成球率达29.70%±6.21%，而原代细胞的成球率为3.30%±1.49%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：采用悬浮培养法在胃癌细胞株MKN-45中分离出的悬浮球体细胞具有自我更新与增殖的CSC的特性。第二部分人胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞的鉴定目的：鉴定悬浮培养法分离的悬浮球体细胞的肿瘤干细胞的特性，为进一步研究胃癌干细胞建立一种实用而有效的细胞模型。方法：①实时定量逆转录-聚合酶链反应检测干性基因Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在球体细胞与贴壁细胞中的表达;②免疫荧光检测干细胞标志物Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在MKN-45悬浮球体细胞及贴壁细胞中的表达；③免疫印迹分析测定干细胞标志物Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在MKN-45悬浮球体细胞的中的表达；④化疗耐受实验：提取培养至14天的MKN-45球体细胞接种于96超孔板低粘附板中，每孔2×103／200ul；取MKN-45贴壁细胞，接种于普通的96孔板中，每孔2×103／200ul。分别在球体细胞及贴壁细胞加入传统化疗药5-Fu及DDP检测，PBS作为内参。药物浓度及作用方式为单药5-Fu(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml),单药DDP(10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml),5-Fu联合DDP(50μg/ml+10μg/ml;100μg/m+20μg/ml;200μg/ml+40μg/m)，化疗药作用24及48小时后，分别加入MTT37C孵化4h，更换150mlDMSO。细胞存活数根据OD450nm(Abs)吸光值评估。；⑤选用雄性无胸腺裸鼠6-8周年龄24只，分别提取培养至14天MKN-45悬浮球体细胞数1×104,2×104,2×105,2×106个，提取相应数量的贴壁细胞作为对照。球体细胞注射在右前背部皮下，原代贴壁细胞注射在左前背部皮下，每7-10天观察肿瘤形成情况，直至8周处死，肿瘤标本固定在10%福尔马林液中，作H&E病理检查。结果：①实时定量PCR与免疫印迹实验显示，球体细胞Oct-4,Sox2,Nanog和CD44的相对表达量分别为2.92±0.44、4.49±0.20、2.34±0.22、1.18±0.04；原代贴壁细胞Oct-4,Sox2,Nanog和CD44的相对表达量分别为1.02±0,06、1.00±0.06、1.00±0.00、1.00±0.05，球体细胞Oct-4,Sox2,Nanog和CD44明显高于原代贴壁细胞(P＜0.05)②免疫荧光显示Oct-4,Sox2以及Nanog蛋白主要在细胞核周围及细胞质中阳性表达，而CD44主要在细胞膜上表达。Oct-4/CD44,Sox2/CD44以及Nanog/CD44双重染色提示胚胎蛋白Oct-4、Sox2以及Nanog均与CD44在同一球体细胞中表达；③5-Fu及DDP作用24小时后，球体细胞呈现明显的药物抵抗能力，球体细胞的存活率明显高于原代贴壁细胞，其中，50μg/ml,100μg/ml及200μg/ml5-Fu作用后，球体细胞的存活率分别为原代贴壁细胞的1.3倍,1.4倍和1.7倍,10μg/ml,20μg/ml及40μg/mlDDP作用后，球体细胞的存活率分别为原代贴壁细胞的1.7倍,3.2倍和3.4倍。作用48小时，无论是5-Fu还是DDP,球体细胞存活率无明显增高,但当5-Fu联合DDP作用24小时后，球体细胞存活率分别为原代贴壁细胞的2.6,2.9以及2.7倍，作用48小时后球体细胞存活率分别为原代贴壁细胞的5.1倍,4.8倍以及5.4倍。④MKN-45球体细胞2×104个细胞即能形成移植瘤，而原代贴壁细胞需要2×106个细胞才能形成移植瘤，球体细胞致瘤能力是原代贴壁细胞的100倍。且球体细胞形成的肿瘤比原代贴壁细胞形成的瘤体大。H&E检查显示球体细胞形成的肿瘤与原代贴壁细胞形成的瘤体的病理改变表现相似，主要是已分化的胃癌细胞。结论:悬浮培养法分离的悬浮球体细胞具有的肿瘤干细胞的特性，这些特性包括自我更新与增殖能力、对传统化疗药物的耐受性、高致瘤能力、干性基因与蛋白的高表达等。该方法为胃癌干细胞的进一步研究提供了一种实用而有效的细胞模型。另外，Oct4/CD44、Sox2/CD44、Nanog/CD44可能分别是胃癌CSC的一种表型。第三部分microRNA在人胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中的表达谱目的：探讨microRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中的表达谱，预测miRNA的靶基因，并分析其在胃癌干细胞中的生物学功能。方法：①采用悬浮培养法分离出球体细胞（胃癌干细胞）；②基因芯片（Agilent’shumanmiRNAmicroarray,version18.0）测定球体细胞（胃癌干细胞）与贴壁细胞间的miRNA的特性表达谱；③RT-PCR验证miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-21-5p,miR-16-5p,miR-27a-3p,miR-22-3p,let-7b-3p,miR-34a-5p,miR-4270,和miR-483-5p这10个miRNA的表达,所有验证均重复三次。④通过MiRanda,TargetScan以及Pictar三个在线数据库对上述10个miRNA作生物信息学分析，预测miRNA的靶基因，并分析其在胃癌干细胞中的生物学功能。这三个在线数据库的网址分别是：miRanda：http://microrna.sanger.ac.uk；TargetScan：http://www.targetscan.org。PicTar：http://www.ncrna.org/KnowledgeBase/link-Database/mirna_target_database,结果：①microRNA芯片检测结果显示，悬浮培养法培养胃癌细胞株MKN-45所形成的悬浮球体细胞与原代贴壁细胞之间有1887个microRNA的表达存在程度不等的差异，其中差异在两倍以上的microRNA有182个，绝大多数（173个）microRNA在球体细胞中表达下调，少部分（9个）表达上调。②qRT-PCR验证结果显示，10个microRNA在球体细胞与原代贴壁细胞间的相对表达量存在明显差异，其中，7个microRNA（miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-21-5p,miR-27a-3p,miR-22-3p，miR-4270以及miR-483-5p）的表达水平与芯片检测结果一致，3个microRNA（miR-16-5p,,let-7b-3p,miR-34a-5p）的表达水平与芯片检测结果不一致，符合率70%③MiRanda,TargetScan以及Pictar三个在线数据库的交集中，有384对miRNA:mRNA配对靶点，其中miR-181a-5p,miR-27a-3p,miR-34a-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-4270,let-7b-3p,以及miR-29a-3p可以预测到靶基因，而miR-483-5p与miR-16-5p未能预测到靶基因。④我们采用CytoScapeR软件对miRNA–mRNA靶基因之间的相互作用的网络作了分析，结果显示，每一个miRNA可以有数十个乃至上百个靶基因，许多靶基因可以是多个miRNA的潜在靶基因，即多个miRNA可以调控同一个靶基因，这些靶基因中的绝大多数与肌动蛋白骨架、粘着斑、胞外基质受体的交互作用以及肿瘤的信号通路有关。特别是许多靶基因与干细胞相关的一些重要的信号通路有关，这些信号通路包括Notch、Wnt/β-catenin、MAPK、mTOR以及JAK-STAT信号通路等。结论：miRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中存在特异性的表达谱，研究miRNA在胃癌干细胞中特异性的表达谱将为深入研究胃癌的发生、发展以及制定针对胃癌干细胞的治疗策略提供新的方法，为彻底根治胃癌带来希望。
【作者】刘建明；
【导师】钱海鑫；
【作者基本信息】苏州大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】胃癌；肿瘤干细胞；球状体；悬浮培养；微小核糖核酸；基因芯片；

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