生长分化因子15(GDF-15)对缺氧诱导的血管内皮细胞凋亡、血管新生的影响及机制研究

生长分化因子15(GDF-15)对缺氧诱导的血管内皮细胞凋亡、血管新生的影响及机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-03 分类:期刊论文 喜欢:3035
师大云端图书馆

【摘要】目的:观察rh-GDF-15干预对缺氧的人源脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及血管新生的影响,探讨其作用机制方法:HUVECs取自健康的剖宫产产妇分娩后新鲜的婴儿脐带,经分离、培养获得;通过化学缺氧的方法模拟体内心肌缺血时的组织缺氧环境;用PCR法测定需要检测的基因(mRNA),用westernblot.检测需要检测的蛋白表达水平,用ELISA法测定HUVECs上清液中GDF-15因子浓度;检测在缺氧(0、2、6、12、24、36、48h)时HUVECs细胞中GDF-15基因和蛋白表达水平及细胞上清液中GDF-15因子浓度;观察rh-GDF-15(0、10、20、50ng/ml)预处理对缺氧24h时HUVECs细胞凋亡的影响;观察rh-GDF-15(0、10、20、50ng/ml)预处理对HUVECs细胞缺氧24h时形成管腔样结构的影响;测定不同浓度rh-GDF-15(0、10、20、50ng/ml)预处理缺氧24hHUVECs细胞Bcl-2、p53蛋白及VEGF和VEGFR2基因表达水平;测定缺氧不同阶段(0、2、6、12、24、36、48h)和rh-GDF-15(0、50ng/ml)预处理条件下HUVCEs胞浆中HIF-1α蛋白表达水平;分别测定rh-GDF-15(50ng/ml)及PBS预处理HUVECs,在缺氧不同阶段(0、12、24、48h)细胞浆及细胞核内HIF-1α蛋白表达水平;观察常氧及缺氧24h状态下,PBS、rh-GDF-15(50ng/ml)、HIF-1αsiRNA和HIF-1αsiRNA+rh-GDF-15(50ng/ml)预处理后HUVECs在MatrigelMatrix上形成管腔结构的结果;检测HUVECs缺氧24h、rh-GDF-15(50ng/ml)和rh-GDF-15(50ng/ml)+HIF-1αsiRNA预处理后VEGF基因及蛋白及VEGFR2蛋白表达水平;观察rh-GDF-15(0、50ng/ml)干预、缺氧24h及常氧条件下HUVECs细胞Sirtl和Mdm2蛋白表达水平;rh-GDF-15(50ng/ml)及nutlin-3(Mdm2的特异性拮抗剂)预处理、HUVECs在不同缺氧时间点胞浆及胞核内p53表达水平;观察rh-GDF-15(50ng/ml)、nutlin-3(10μmol/L(Mdm2的特异性拮抗剂)及rh-GDF-15(50ng/ml)+nutlin-3预处理、HUVECs缺氧24h条件下Mdm2-p53免疫复和物、不同缺氧时间点(0、2、6、12、24h)胞浆和胞核内p53、缺氧6h后HIF-1α蛋白和VEGF基因表达水平。结果1、HUVECs在缺氧2h时细胞中GDF-15的mRNA水平较0h、6h、12h、24h、36h、48h显著上调(p<0.05),随缺氧时间延长,表达水平逐渐下调(灰度比分别为0.77±0.08vs0.22±0.04、0.33±0.09、0.35±0.04、0.29±0.09、0.19±0.06、0.15±0.04);缺氧2h、6h时细胞中蛋白水平较0h、12h、24h、36h、48h明显升高(p<0.05),随着缺氧时间延长,蛋白水平逐渐下调,(灰度比分别为0.36±0.04、0.30±0.00vs0.06±0.00、0.15±0.02、0.10±0.03、0.09±0.02、0.06±0.01,p<0.05);细胞上清液中GDF-15水平缺氧2h组较0h、12h、24h、36h、48h显著上调(p<0.05),随着缺氧时间延长,逐渐下调,(灰度比分别为11.93±1.55vs3.43±0.76、4.73±0.76、4.6±1.3、4.0±0.56、3.43±1.04,p<0.05)。2、用rh-GDF-15(0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL)不同浓度预处理组HUVECs缺氧24h时细胞凋亡指数分别是(22.0±3.16)%、(17.8±3.90)%、(15.6±5.68)%、(13.4±3.58)%,提示rh-GDF-15预处理可减少HUVECs缺氧24h时细胞凋亡,且呈浓度依赖性;随浓度增加,凋亡指数逐渐减少,rh-GDF-15(50ng/mL)组较不加rh-GDF-15组凋亡指数有显著性差异{(22.0±3.16)%vs(13.4±3.58)%,p<0.05};3、缺氧24h时HUVECs在MatrialMatrix上几乎无管腔样结构,用不同浓度rh-GDF-15(0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL)预处理后出现管腔样结构,随着rh-GDF-15浓度增大,形成的管腔样结构越明显、越多。rh-GDF-15(20ng/mL和50ng/mL)组较(0ng/mL)组有明显差异(5.67±0.58、7.00±1.00vs1.00±1.00,p<0.05;)4、不同浓度rh-GDF-15(0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL)预处理缺氧24hHUVECs细胞Bcl-2表达上调,呈浓度依赖性,rh-GDF-15(50ng/mL)组灰度比较(0ng/mL)组有显著性差异(0.79±0.22vs0.51±0.12,p<0.05);VEGF表达上调,且呈剂量依赖,rh-GDF-15(50ng/mL)组较(0ng/mL)组有显著性差异(0.67±0.06vs0.14±0.06,p<0.05);而p53蛋白表达下调亦呈浓度依赖性,rh-GDF-15(50ng/mL)组较(0ng/mL)组有显著性差异(0.38±0.06vs0.74±0.19,p<0.05);VEGFR2基因表达无明显变化;5、缺氧2h时胞浆HIF-1α蛋白表达较缺氧前显著增加(灰度比0.67±0.12vs0.38±0.10,p<0.05);随着缺氧时间延长,HIF-1α蛋白表达逐渐减少,至12h时已低于缺氧前水平。用rh-GDF-15预处理后缺氧HUVECs胞浆内HIF-1α表达虽随时间延长而有减少的趋势,但在24h、36h、48h时较未用rh-GDF-15预处理组比较有显著性差异(灰度比0.49±0.13vs0.19±0.09,0.42±0.08vs0.12±0.05,0.37±0.10vs0.07±0.03,p均<0.05);用rh-GDF-15预处理后,缺氧HUVECs胞核内HIF-1α蛋白表达较对照组显著上调,各个时间段比较均有统计学差别,(灰度比0.16±0.03vs0.04±0.02,0.33±0.02vs0.03±0.01,0.43±0.03vs0.05±0.02,0.29±0.02vs0.04±0.01,p均<0.05);6、缺氧HUVEC经rh-GDF-15预处理后在MatrigelMatrix上形成管腔结构;加入HIF-1αsiRNA及加入HIF-1αsiRNA+rh-GDF-15后,均未在MatrigelMatrix上形成管腔结构。7、HUVECs缺氧24h条件下、rh-GDF-15(50ng/ml)+HIF-1αsiRNA干预后VEGF转录和翻译水平显著低于单用rh-GDF-15(50ng/ml)干预(灰度比比较分别为0.19±0.02VS0.60±0.01,0.0800±0.01604vs0.1871±0.01694,p<0.05);而VEGFR2蛋白表达水平两组无显著差别,8、常氧条件下rh-GDF-15(50ng/ml)预处理,HUVECs细胞Sirtl和Mdm2表达水平与未预处理组无显著差异;在缺氧条件下rh-GDF-15(50ng/ml)预处理使Mdm2蛋白表达水平显著上调(灰度比0.6912±0.02732vs0.5405±0.05291,p<0.05),而Sirtl表达水平无显著差异;9、rh-GDF-15(50ng/ml)预处理、HUVECs缺氧24h条件下胞浆内p53表达上调,而胞核内p53表达下调,用nutlin-3预处理,HUVECs缺氧条件下胞浆内p53表达下调,而胞核内p53表达上调;10、免疫共沉淀结果显示HUVECs在缺氧24h后,细胞内P53蛋白与Mdm2蛋白存在相互关系,经过rh-GDF-15(50ng/ml)预处理后P53与Mdm2形成复合物增加,同时HIF-1α及VEGF的表达也相应上调、但是使用nutlin-3及rh-GDF-15(50ng/ml)+nutlin-3预处理后Mdm2-p53免疫复和物、HIF-1α及VEGF表达下调;结论1、GDF-15可明显抑制缺氧状态下血管内皮细胞的凋亡,促进内皮细胞增殖和血管新生;2、GDF-15通过激活Mdm2蛋白增加了血管内皮细胞缺氧过程中积聚的p53蛋白降解和出核效应,下调胞核内p53表达,上调HIF-1α蛋白的表达,继而上调VEGF表达即通过Mdm2—HIF-1α/p53—VEGF信号系统,减少了内皮细胞的凋亡,促进血管新生的形成。
【作者】宋和鉴;
【导师】刘志华;
【作者基本信息】苏州大学,心血管内科,2014,博士
【关键词】GDF-15;血管新生;凋亡;Mdm2;HIF-1α/p53;VEGF;

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