长期限食及模拟限食下调微囊泡中miR-21可延缓肾脏衰老相关纤维化的调控机制

【摘要】目的：：肾脏随年龄的增长出现肾小球硬化及肾小管-间质纤维化，主要原因是胞外基质（ECM）的大量堆积。肾小管上皮细胞间充质改变（EMT）被认为是ECM过度沉积的主要原因之一。既往研究发现肾脏衰老常伴随肾间质纤维化，并有部分研究证明，SASP在衰老相关纤维化中扮演重要角色，但具体机制尚不清楚。因此，本研究利用肾脏自然衰老以及长期限食延缓肾脏衰老模型，探索分泌性microRNA对肾小管上皮细胞间充质改变产生影响的可能机制，为临床预防及延缓肾脏衰老相关纤维化提供重要线索。方法：1.实验用F344雄性大鼠，分为3组：YAL：3月龄，自由饮食；OAL：24月龄，自由饮食；OCR：24月龄，限食8个月，饮食热量为OAL的70%。体内试验利用SA-β-gal染色，Masson染色、免疫组化、westernblot比较三组大鼠肾脏衰老、肾间质纤维化、EMT程度及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)、低氧诱导因子HIF1α指标的变化；利用QRT-PCR比较三组肾组织以及尿液微囊泡中miR-21的表达情况。2.分离培养人原代近端肾小管上皮细胞（HPTCs）并鉴定,高糖（33mM）刺激不同时间，通过westernblot、SA-β-gal染色、细胞免疫荧光观察衰老与EMT之间的先后关系。3.为明确衰老HPTCs是否通过旁分泌含有miR-21微囊泡促进邻近细胞发生EMT，限食是否延缓衰老进而抑制微囊泡中miR-21分泌，我们利用白藜芦醇模拟体外限食，分三步骤：首先高糖(HG)或者HG和白藜芦醇共刺激HPTCs，观察细胞衰老情况、以及微囊泡、细胞中miR-21的含量；其次，比较对照组、HG、HG和miR-21inhibitor、miR-21mimics组中细胞及微囊泡中miR-21含量；最后收集前者所述各分组中所分泌微囊泡刺激受体HPTCs，观察受体细胞EMT发生。4.为进一步研究miR-21是否通过靶向调控PPARα，经HIF1α促进肾脏纤维化，我们利用非诺贝特激动PPARα,siRNA技术敲除HIF1α，验证miR-21-PPARα-HIF1α在肾脏纤维化过程中所起作用。结果：1.长期限食能明确改善大鼠衰老及纤维化，并降低衰老肾组织或者尿液外泌体中miR-21的表达。PPARα蛋白表达高低顺序为YAL>OCR>OAL,HIF1α表达高低顺序为OAL>OCR>YAL。2.高糖诱导HPTCs24h后出现SA-β-gal染色阳性，肾小管上皮细胞细胞衰老表型（P53、P21表达升高，P<0.05）发生。而高糖刺激48h后EMT标志物vimentin及α-SMA升高具有统计学意义（p<0.05）,72h后E-cadherin下降具有统计学意义,且细胞的免疫荧光显示，相比0h，高糖刺激72hE-caherin表达明显下降，α-SMA表达明显升高因此，明确高糖诱导的HPTCs衰老表型改变早于EMT。3.收集微囊泡刺激正常HPTCs48h，与control比较，HG、miR-21mimics组细胞及微囊泡中miR-21升高（P<0.05），E-cadherin下降，vimentin及α-SMA表达升高（P<0.05）;与HG比较，HG+RSV、HG+miR-21inhibitor组细胞及微囊泡中miR-21降低（P<0.05），E-cadherin上升，vimentin及α-SMA表达降低（P<0.05）。4.将miR-21mimics或miRnegativecontrol转染HPTCs细胞，检测PPARα的表达改变。与control、miRnegativecontrol组相比，miR-21mimics组的PPARα的蛋白表达下降(p<0.05)，而PPARα的mRNA水平没有变化(p>0.05)，表明，miR-21可能通过转录后水平对PPARα进行调控。结合既往研究结果，PPARα是miR-21的直接靶基因。5.将miR-21inhibitor或miR-21mimics转染HPTCs,24h后换液，miR-21inhibitor组给予HG刺激，48h后观察各组EMT程度。与control、miRnegativecontrol比较，HG、miR-21mimics、HG+miRnegativecontrol组，E-cadherin下降，vimentin及α-SMA表达升高（P<0.05），HIF1a升高（P<0.05）；与HG组比较，HG+miR-21inhibitor组,E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表达降低（P<0.05），HIF1α降低（P<0.05）。6.选用PPARα激动剂非诺贝特(Fenofibrate)和HG/miR-21mimics共刺激HPTCs。与HG、miR-21mimics组比较，HG+Fenofibrate、miR-21mimics+Fenofibrate组,E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表达降低（P<0.05），HIF1a降低（P<0.05）。7.通过siRNA-HIF1α抑制HIF1α的活性,与HG、HG+NC组比较，HG+siHIF1α组E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表达降低（P<0.05）；与mimics、mimics+NC组比较，mimics+siHIF1α组E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表达降低（P<0.05）。结论：1.长期限食可延缓衰老及衰老相关纤维化，并降低衰老肾组织及尿液微囊泡中miR-21表达。2.白藜芦醇模拟体外限食可改善高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞衰老并阻止其旁分泌含有miR-21微囊泡促进EMT这一过程。3.MiR-21靶向调控PPARα，通过HIF1α促进人肾近端肾小管上皮细胞EMT发生。
【作者】刘金瑞；
【导师】邹洪斌；蔡广研；
【作者基本信息】吉林大学，临床医学，2014，硕士
【关键词】衰老；长期限食；EMT；外泌体；miR-21；

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