神经肽FF在糖尿病角膜病变中的作用及分子机制研究

【摘要】目的：糖尿病角膜病变广泛存在于糖尿病患者中,危害较大且至今仍缺乏理想的防治措施,目前认为角膜的神经病变使其感觉、营养和代谢功能障碍,是引起角膜病反复发作、难治疗的根本原因。通过PCRarray技术对2型糖尿病模型BKS.Cg-m+/+Leprdb/J小鼠(简称BKS-db/db小鼠)三叉神经节中神经营养因子及其受体的差异基因筛选,我们发现神经肽FF(NeuropeptideFF,NPFF)表达显著下调。本研究旨在进一步研究NPFF在BKS-db/db小鼠角膜和三叉神经节中的表达及定位情况,并探讨NPFF在糖尿病角膜病变中的作用及相关分子机制。方法：1、体内动物实验本研究体内动物实验采用24w龄BKS-db/db小鼠及其对照db/+小鼠各40只,通过角膜知觉检测、泪液分泌实验以及β-tublin角膜神经染色客观评价糖尿病角膜病变的发生情况。通过神经逆行示踪方法,结膜下注射荧光金标记三叉神经节眼支来源的神经节细胞,采用免疫组化和荧光技术显示NPFF及其受体在BKS-db/db小鼠及其对照鼠三叉神经节的细胞定位及表达,并通过ELISA检测NPFF蛋白在角膜和三叉神经节的表达情况。在已建立好的BKS-db/db小鼠角膜上皮刮除模型上,结膜下注射NPFF或者空白对照药物PBS,通过荧光素钠染色动态观察角膜上皮愈合的情况,通过角膜知觉、以及角膜神经染色评价角膜末梢神经修复情况。2、体外细胞实验体外培养小鼠角膜缘干细胞系TKE2以及原代培养小鼠三叉神经节细胞,实验设置6个组：表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor,EGF)阳性对照组、甘露醇渗透压对照、高糖培养、高糖联合10μmol/L浓度NPFF,高糖联合100μmol/L浓度NPFF、PBS培养组。通过细胞划痕实验检测NPFF对TKE2细胞迁移和增殖能力的影响,通过实时定量PCR、westernblot实验检测AKT、ERK1/2等信号通路基因和蛋白的表达。通过Live/Dead试剂盒检测NPFF对体外培养的三叉神经节细胞生长及存活情况的影响。结果：通过血糖及体重等一般生长指标监测,以及角膜知觉检测和神经染色,24w龄BKS-db/db小鼠均出现糖尿病角膜病变的典型特征：泪液分泌异常、角膜知觉减退和末梢神经异常等。通过荧光金逆行示踪,成功标记三叉神经节中眼支来源的神经节细胞,并在胞体中检测到NPFF及其受体的表达。免疫荧光、免疫组化、RT-PCR及ELISA检测显示,与db/+对照小鼠比较,NPFF在BKS-db/db小鼠中表达显著下降。与PBS对照组相比,结膜下注射NPFF可以显著促进BKS-db/db小鼠角膜上皮损伤后的愈合,并可以促进角膜末梢神经的修复及其功能恢复。细胞划痕实验证实NPFF能够显著促进高糖环境下TKE2细胞的迁移和增殖,Live/Dead检测显示NPFF还能明显延长体外培养的三叉神经节细胞的存活时间；westernblot初步证实NPFF可以在处理5min后特异性激活ERK1/2信号通路,该信号通路与细胞增殖和生长有关,而对AKT信号通路没有明显影响。结论：24w龄BKS-db/db小鼠出现典型糖尿病角膜病变的特征,可以作为研究2型糖尿病角膜病变的动物模型。NPFF在2型糖尿病模型BKS-db/db小鼠角膜和三叉神经节中表达显著下降,体内和体外实验表明NPFF具有促进角膜末梢神经损伤修复和功能恢复以及延长三叉神经节细胞体外存活时间的作用,NPFF可能是一种潜在的神经保护因子,为糖尿病角膜病变的防治提供了新的研究思路,但具体作用机制仍需进一步研究。
【作者】代云海；
【导师】谢立信；
【作者基本信息】青岛大学，眼科学，2014，博士
【关键词】神经肽FF；糖尿病角膜病变；神经再生；三叉神经节；

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