RNAi沉默HIF-1α对卵巢癌细胞SKOV3化疗敏感性的影响

RNAi沉默HIF-1α对卵巢癌细胞SKOV3化疗敏感性的影响

作者:师大云端图书馆 时间:2019-12-01 分类:参考文献 喜欢:2585
师大云端图书馆

【摘要】研究目的:通过构建并表达HIF-1-siRNA的重组质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,观察RNA干扰下,HIF-1α基因在mRNA及蛋白水平的表达变化,以及对卵巢癌细胞顺铂化疗敏感性的相关影响。实验方法:根据HIF-1mRNA序列设计特异性siRNA插入序列并在体外合成,将其克隆进线性化的质粒pEGFP-C1,通过DNA测序验证插入序列正确与否。将重组质粒转染SKOV3细胞。实验分三组:①正常对照组(空白组);②非特异性转染组(pEGFP-C1组,转染非特异性质粒);③特异性转染组(pEGFP-HIF-1siRNA组,转染特异性pEGFP-HIF-1siRNA质粒)。分别提取三组细胞总RNA和总蛋白后,通过利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和Westernblot技术检测HIF-1α在mRNA和蛋白的表达水平,通过MTT法和流式细胞术检测顺铂作用下转染前后细胞生长抑制及凋亡情况。结果:重组的阳性质粒经测序分析确认目的DNA片段已成功克隆入载体pEGFP-C1中。空白对照组和非特异转染组对HIF-1αmRNA(pEGFP-C1组)表达抑制率(HIF-1α/β-actin)分别为65%、64.2%,而pEGFP-HIF-1siRNA组对HIF-1αmRNA表达抑制率(HIF-1α/β-actin)为15%。重组质粒转染72h抑制率达约50%。空白组、pEGFP-C1转染组、pEGF-HIF-1siRNA转染组对HIF-1α蛋白表达抑制率(HIF-1α/β-actin)分别为63.2%、65.6%、14.3%。重组质粒转染72h抑制率为51.3%。.MTT检测顺铂作用后pEGF-HIF-1siRNA转染组细胞增殖活性受抑制,细胞生长缓慢,与对照组相比,在72h和96h时间点吸光度值较其他组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测顺铂作用下三组细胞在感染72h后凋亡率,pEGFP-HIF-1siRNA组细胞的凋亡率为39.91%,空白对照组和pEGFP-C1组细胞凋亡率分别为5.76%和6.63%。结论:RNAi技术通过构建表达HIF-1-siRNA的重组质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,能够使有效地抑制卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因在mRNA和蛋白水平上的转录和表达;同时能够抑制SKOV3体外生长活性,增强其对顺铂化疗药物的敏感性。
【作者】孟迪;
【导师】刘爱民;
【作者基本信息】吉林大学,妇产科学,2014,硕士
【关键词】卵巢癌;RNA干扰;缺氧诱导因子-1α;化疗敏感性;

【参考文献】
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