RNAi沉默HIF-1α对卵巢癌细胞SKOV3化疗敏感性的影响

【摘要】研究目的：通过构建并表达HIF-1-siRNA的重组质粒，转染人卵巢癌细胞SKOV3，观察RNA干扰下，HIF-1α基因在mRNA及蛋白水平的表达变化，以及对卵巢癌细胞顺铂化疗敏感性的相关影响。实验方法：根据HIF-1mRNA序列设计特异性siRNA插入序列并在体外合成，将其克隆进线性化的质粒pEGFP-C1，通过DNA测序验证插入序列正确与否。将重组质粒转染SKOV3细胞。实验分三组：①正常对照组（空白组）；②非特异性转染组（pEGFP-C1组，转染非特异性质粒）；③特异性转染组（pEGFP-HIF-1siRNA组，转染特异性pEGFP-HIF-1siRNA质粒）。分别提取三组细胞总RNA和总蛋白后，通过利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和Westernblot技术检测HIF-1α在mRNA和蛋白的表达水平，通过MTT法和流式细胞术检测顺铂作用下转染前后细胞生长抑制及凋亡情况。结果:重组的阳性质粒经测序分析确认目的DNA片段已成功克隆入载体pEGFP-C1中。空白对照组和非特异转染组对HIF-1αmRNA（pEGFP-C1组）表达抑制率（HIF-1α/β-actin）分别为65%、64.2%，而pEGFP-HIF-1siRNA组对HIF-1αmRNA表达抑制率（HIF-1α/β-actin）为15%。重组质粒转染72h抑制率达约50%。空白组、pEGFP-C1转染组、pEGF-HIF-1siRNA转染组对HIF-1α蛋白表达抑制率（HIF-1α/β-actin）分别为63.2%、65.6%、14.3%。重组质粒转染72h抑制率为51.3%。.MTT检测顺铂作用后pEGF-HIF-1siRNA转染组细胞增殖活性受抑制，细胞生长缓慢，与对照组相比，在72h和96h时间点吸光度值较其他组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术检测顺铂作用下三组细胞在感染72h后凋亡率，pEGFP-HIF-1siRNA组细胞的凋亡率为39.91%，空白对照组和pEGFP-C1组细胞凋亡率分别为5.76%和6.63%。结论：RNAi技术通过构建表达HIF-1-siRNA的重组质粒，转染人卵巢癌细胞SKOV3，能够使有效地抑制卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因在mRNA和蛋白水平上的转录和表达;同时能够抑制SKOV3体外生长活性，增强其对顺铂化疗药物的敏感性。
【作者】孟迪；
【导师】刘爱民；
【作者基本信息】吉林大学，妇产科学，2014，硕士
【关键词】卵巢癌；RNA干扰；缺氧诱导因子-1α；化疗敏感性；

【参考文献】
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