减毒沙门氏菌介导的Apoptin对喉癌的抑制效应研究

【摘要】本研究基于我们先前对凋亡素（Apoptin）基因的研究，利用减毒沙门氏菌载体系统，构建了具有肿瘤特异杀伤能力和肿瘤特异增殖能力的重组减毒沙门氏菌。目的:探讨重组减毒沙门氏菌对喉癌细胞Hep-2的体外抑制作用，研究其对裸鼠荷人喉癌动物模型实体肿瘤的体内抑制效应。为研发安全、靶向、高效和无耐药的新型抗喉癌基因治疗候选药物奠定物质和理论基础，并为喉癌基因治疗的基础和应用研究积累经验。方法:通过电转移和抗生素加压筛选等步骤获得含有Apoptin基因的重组减毒沙门氏菌（rC-Apoptin）。以rC-Apoptin感染体外培养的人喉癌细胞Hep-2，通过westernblot、RT-PCR等方法对外源基因Apoptin的表达进行验证；通过MTT检测其对体外培养的Hep-2细胞的抑制作用；利用AO/EB染色在体外细胞培养水平验证rC-Apoptin诱导Hep-2细胞凋亡的功能。建立裸鼠荷人喉癌动物模型，尾静脉注射重组减毒沙门氏菌，通过检测抑瘤率、生存期、肿瘤生长趋势等方法研究重组减毒沙门氏菌对体内人喉癌实体肿瘤的抑制作用；分离裸鼠荷人喉癌模型动物肿瘤组织，通过组织切片，利用光学显微镜观察rC-Apoptin对实体肿瘤的抑制作用；通过细菌分布分析和对多脏器组织切片观察，了解沙门氏菌在机体的分布以及对其他脏器的影响。结果:表达Apoptin基因的重组减毒沙门氏菌所携带外源基因可在Hep-2细胞内有效表达。rC-Apoptin对体外培养的Hep-2细胞具有杀伤作用，并且其杀伤作用存在一定的量效和时效关系。rC-Apoptin能够有效抑制体内实体喉癌的生长，延长动物生存期，重复注射rC-Apoptin可明显延长肿瘤倍增时间（TDT，tumordoublingtime）延长肿瘤迟滞时间(TGD，tumorgrowthdelay)。重组减毒沙门氏菌在肿瘤组织的富集量是肝脏富集量的1000倍。且该重组减毒沙门氏菌未对模型动物肝、肺和肾等器官造成不良影响。结论：成功构建了表达Apoptin的重组减毒沙门氏菌rC-Apoptin。rC-Apoptin感染Hep-2后能有效表达外源基因Apoptin。rC-Apoptin能够有效抑制在体外培养的人喉癌细胞Hep-2的生长，并且这种抑制作用在高剂量条件下呈现时间效应依赖关系；在较长感染周期条件下呈现剂量效应依赖关系。rC-Apoptin不仅具有抑制模型动物Hep-2实体喉癌生长的功能，还可以有效提高模型动物生存率。
【作者】曹弘薇；
【导师】管国芳；
【作者基本信息】吉林大学，耳鼻咽喉科学，2014，硕士
【关键词】减毒沙门氏菌；凋亡素；喉癌；细胞凋亡；肿瘤特异性；

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