小胶质细胞失稳态在光损伤视网膜变性中的作用研究

小胶质细胞失稳态在光损伤视网膜变性中的作用研究

作者:师大云端图书馆 时间:2016-02-13 分类:期刊论文 喜欢:2053
师大云端图书馆

【摘要】以年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)、原发性视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)等为代表的外层视网膜变性性疾病是目前世界范围内主要的致盲眼病之一,其共同的病理改变为光感受器细胞不可逆性的凋亡。此类疾病的分子病理机制及治疗是目前研究的难点。近年来小胶质细胞的作用逐渐受到重视。光感受器损伤后激活小胶质细胞,导致进一步神经元损伤已得到证实。但光感受器损伤和小胶质细胞激活之间的分子对话机制仍不清楚,阻止该过程成为从同一途径延缓视网膜变性发展的关键。研究提示趋化因子Fractalkine可能是二者功能对话的重要介质。本研究采用光损伤视网膜模型、体外光感受器和小胶质细胞共培养模式,研究Fractalkine及受体CX3CR1信号在光感受器损伤后的时空变化,着力于分析该信号的变化规律及与视网膜小胶质细胞激活、神经元凋亡之间潜在的关系,并深入探讨其调控小胶质细胞激活的细胞内信号途径,阐明神经元损伤和小胶质细胞激活之间的分子机制,为延缓视网膜变性疾病的进展开拓新治疗思路。第一部分Fractalkine/CX3CR1在光损伤大鼠模型中的表达时空变化规律及与小胶质细胞和神经元关系的研究目的:探讨Fractalkine及其受体CX3CR1在光损伤大鼠模型中的表达时空变化规律,并着重分析比较其时空变化与神经元凋亡及小胶质细胞迁移活化之间的可能关系。方法:将SD大鼠置于光损伤箱中接受24h强度为25001ux的宽谱蓝光照射,制成Ⅰ型光损伤动物模型,选取光损伤后的2h、6h、1d、3d、5d、7d为观察检测时间点。采用HE(hematoxylinandeosin)染色观察不同时间节点光损伤大鼠外核层的厚度及感光细胞数目变化情况。采用免疫组化荧光观察视网膜病变不同阶段小胶质细胞的活化迁移及Fractalkine/CX3CR1的表达部位及表达量的变化,用原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测视网膜光感受器凋亡情况,利用Westernblot、RealTime-PCR检测Fractalkine/CX3CR1、炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白及mRNA表达变化情况,进一步从分子信号水平观察MAPK家族的表达变化情况。综合以上检测结果分析寻找Fractalkine/CX3CR1与光感受器凋亡、小胶质细胞迁移活化及炎症因子分泌之间的关系。结果:HE染色显示光损伤后大鼠视网膜出现进行性光感受器减少和外核层变薄,且光感受器内外节结构紊乱。免疫荧光显示光损伤后感光细胞层出现Fractalkine表达增多,与小胶质细胞活化迁移的位置较一致,其受体CX3CR1在视网膜内主要表达于小胶质细胞。Westernblot、RealTime-PCR可见Fractalkine/CX3CR1蛋白和mRNA出现表达上调,分别在损伤后1d、3d达到表达高峰。UNEL结果显示光损伤后2h即出现明显的感光细胞凋亡并随着时间推移凋亡细胞数目增多,1d时达到凋亡高峰。观察发现炎症因子TNF-α、IL-1β以及MAPK家族中p-p38,p-p44/22和p-SAPK/JNK均出现了与上述指标相吻合的表达水平波动。结论:趋化因子Fractalkine及受体CX3CR1可能是视网膜感光细胞损伤和小胶质细胞激活之间的重要分子对话机制,MAPK家族可能参与了Fractalkine/CX3CR1调控小胶质细胞激活的细胞内信号途径的过程或者光诱导感光细胞凋亡的过程。第二部分Fractalkine/CX3CR1对体外共培养体系光感受器损伤和小胶质细胞激活之间分子对话作用的研究目的:探讨损伤后的光感受器和视网膜小胶质细胞激活之间的交互对话信号,主要关注点是趋化因子Fractalkine及其受体CX3CR1在光损伤光感受器变性性疾病中的作用。方法:将SD大鼠视网膜原代培养的小胶质细胞与感光细胞系661W在transwell小室中进行共培养,并置于特制的细胞照光箱中接受5h宽谱蓝光照射制成细胞光损伤模型,选取光损伤后的6h、12h、24h、36h、48h为观察检测时间点。在共培养体系中预先加入CX3CR1中和性封闭抗体或膜结合形式Fractalkine或小分子可溶性Fractalkine作为不同的干预组。采用Elisa法检测可溶性小分子Fractalkine、炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌情况,TUNEL法检测感光细胞系661W凋亡情况,通过趋化实验观察可溶性小分子Fractalkine对小胶质细胞迁移的作用。结果:蓝光损伤后70%-80%的感光细胞系661W出现了凋亡,与之共培养的小胶质细胞则出现了激活的形态学表现,由分支状变为阿米巴状,并且小分子Fractalkine和炎症因子在细胞上清液中的表达升高。与对照组相比,在CX3CR1中和性封闭抗体组出现了较多的感光细胞存活,加入外源性的膜结合形式Fractalkine和小分子可溶性Fractalkine分别表现出为减少感光细胞凋亡和促进小胶质细胞迁移的作用。结论:初步证实了蓝光损伤感光细胞系661W可导致Fractalkine裂解,并通过Fractalkine/CX3CR1途径激活小胶质细胞。而激活的小胶质细胞可释放炎症因子反过来加重感光细胞原有的损伤。对趋化因子Fractalkine及受体CX3CR1参与视网膜感光细胞损伤和小胶质细胞激活之间的分子对话的研究,为延缓视网膜变性疾病的进展开拓新治疗思路,进一步将研究Fractalkine/CX3CR1激活小胶质细胞的细胞内信号途径,为调控该信号通路、抑制小胶质细胞过度激活开辟新的治疗途径提供理论依据。
【作者】张萌;
【导师】徐格致;
【作者基本信息】复旦大学,眼科学,2013,博士
【关键词】光损伤视网膜变性;Fractalkine;CX3CR1;小胶质细胞;光感受器;

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