hCLOCK基因在结直肠癌中的表达及其促进肿瘤进展的作用与机制研究

hCLOCK基因在结直肠癌中的表达及其促进肿瘤进展的作用与机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2016-02-08 分类:期刊论文 喜欢:2168
师大云端图书馆

【摘要】生物钟基因是设定并调控机体出现昼夜节律周期的系统,是一种以近似24小时为周期的振荡器。hCLOCK基因处于生物钟基因家族的中心,其表达及功能的改变,导致机体生物节律失调,从而促进肿瘤发生发展。结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,尽管在手术切除、化疗以及放疗方面都取得了不小进展,但结直肠癌死亡率仍居高不下,寻找更多新的影响结直肠癌发生发展的关键基因或特异的分子标志物,研究其功能,对结直肠癌的诊断、预后监测以及新的抗肿瘤药物的研制都具有重要意义。本研究将分为四部分,就hCLOCK基因在结直肠癌中的表达及其促进肿瘤进展的作用与机制进行体内外系统研究,以期为以hCLOCK基因成为新的靶点治疗结直肠肿瘤提供理论依据。第一部分hCLOCK基因及部分其下游调控基因在人结直肠癌中的表达目的1.分析hCLOCK基因在人结直肠癌及配对正常肠道粘膜组织中表达的差异,及其与病理、临床资料的关系;2.检测hCLOCK下游调控基因,包括(1)生物钟基因hPER2;(2)肿瘤血管新生相关基因(HIF-1α、ARNT、VEGF);及(3)细胞凋亡相关基因(BAK、BAX、BID、TNFRI、TNFRII)在结直肠肿瘤中的表达,并分析与hCLOCK表达改变的相关性。方法1.免疫组化方法检测hCLOCK蛋白及hPER2蛋白在癌组织与配对正常组织中的表达;2.荧光定量实时PCR方法检测hCLOCK基因及部分其下游调控基因(HIF-1a、ARNT、VEGF、BAK、BAX、BID、TNFRI、TNFRI)在癌组织与配对正常组织中mRNA水平表达的差异。结果1.在结直肠癌及癌旁正常肠道粘膜中hCLOCK、hPER2均有表达;hCLOCK蛋白在结直肠癌中表达增高,而hPER2蛋白在结直肠癌中表达下调(P<0.01);2.hCLOCK蛋白在结直肠癌中表达上调与患者肿瘤有无发生淋巴结转移、及TNM分期有显著相关性。在发生淋巴、血运转移的患者中,hCLOCK在肿瘤灶中的表达增高(P<0.05);3.hCLOCK在肿瘤灶中表达增高与hPER2的表达下调相关(P<0.05);患者年龄愈小,结直肠癌组织分化程度愈低,浸润深度愈深,已发生淋巴结转移、TNM分期愈晚,hPER2基因蛋白表达率也愈低(P<0.05);4.与配对正常肠道粘膜组织相比,在人结直肠癌组织中,hCLOCK基因mRNA表达水平明显增高(P<0.01),而hPER2mRNA表达水平无明显差异;5.hCLOCK在肿瘤中的表达与肿瘤血管新生相关基因ARNT、HIF-1α及VEGF表达水平呈线性正相关(P<0.05),而与BAK、BAX、BID、TNFRI及TNFRⅡ等凋亡通路相关基因表达尚未见明显相关性。结论1.生物钟基因hCLOCK在人结直肠癌中表达水平升高,并且与肿瘤进展、淋巴结、血运转移相关;2.生物钟基因hPER2蛋白在结直肠癌中表达下调,并且与患者年龄、肿瘤组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期都有一定相关性;3.hCLOCK在肿瘤灶中表达增高与hPER2的表达下调相关;4.hCLOCK在结直肠癌中的表达与肿瘤血管新生相关基因ARNT、HIF-1α及VEGF表达水平呈线性正相关。第二部分结直肠癌细胞株中hCLOCK基因的表达目的1.检测hCLOCK基因在四株人结直肠癌细胞株HT29、LoVo、SW480、SW620中的表达情况;分析hCLOCK的表达与不同肿瘤细胞株细胞运动、侵袭、转移能力的关系;2.筛选出hCLOCK基因表达水平较高及较低的结直肠癌细胞株各一株,进行后续hCLOCK功能研究。方法1.WesternBlot法检测蛋白表达;2.荧光定量实时PCR方法检测基因mRNA表达。结果1.hCLOCK在高转移性结直肠癌细胞株SW620中mRNA及蛋白表达均最高;2.hCLOCK在低转移性结直肠癌细胞株SW480中表达水平较低。结论1.hCLOCK基因的高表达与肿瘤细胞恶性程度高,转移性强相关;2.选取SW620细胞株作为hCLOCK的高表达本体,SW480细胞株作为hCLOCK的低表达本体,进行后续hCLOCK功能研究。第三部分过表达及干扰hCLOCK表达慢病毒载体的构建和包装目的1.构建并包装带有特定hCLOCK基因序列的慢病毒颗粒,以稳定表达目的基因hCLOCK;2.构建并包装带有特定hCLOCKRNAi干扰靶点的慢病毒颗粒,以稳定沉默目的基因hCLOCK的表达。方法1.构建慢病毒载体重组质粒;2.慢病毒包装。结果1.成功制备高表达hCLOCK基因的慢病毒浓缩液hCLOCK/GV186;2.成功制备干扰hCLOCK表达的慢病毒浓缩液hCLOCK/GV113-RNAi。第四部分hCLOCK促进结直肠癌细胞增殖及侵袭转移的作用与机制研究目的1.制备高表达hCLOCK的结直肠癌细胞SW480-hCLOCK,以感染空载体病毒的SW480-Vec作为对照组;2.制备干扰hCLOCK表达的结直肠癌细胞SW62O-shhCLOCK;并以感染空载体病毒的SW620-Vec作为对照组;3.研究hCLOCK的表达对结直肠肿瘤细胞增殖、凋亡、转移等细胞生物学活性的影响;4.检测实验组及对照组中肿瘤血管新生相关基因(VEGF、ARNT、HIF-1α)、凋亡相关基因(AKT、P-AKT、BID、BAX)的蛋白表达情况,以期进一步明确hCLOCK是否可能通过影响肿瘤血管新生及细胞凋亡通路,从而促进结直肠肿瘤进展、转移的分子机制。方法1.将高表达hCLOCK基因的慢病毒浓缩液hCLOCK/GV186感染SW480细胞;通过荧光检测及WesternBlot检测验证SW480-hCLOCK中hCLOCK的表达较感染空载体病毒的SW480-Vec组明显增高;2.将干扰hCLOCK表达的慢病毒浓缩液hCLOCK/GV113-RNAi感染SW620细胞;通过荧光检测及WesternBlot检测验证SW620-shhCLOCK中hCLOCK的表达较感染空载体病毒的SW620-Vec组明显降低;3.MTT实验、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞的增殖、凋亡、侵袭情况;4.WesternBlot技术检测实验组及对照组中肿瘤血管新生相关基因(VEGF、ARNT、HIF-1α、凋亡相关基因(AKT、P-AKT、BID、BAX)的蛋白表达情况。结果1.SW480-hCLOCK较SW480-Vec细胞增殖加快;SW620-shhCLOCK较SW620-Vec细胞增殖减慢(P<0.01);2.SW480-hCLOCK较SW480-Vec细胞凋亡减少;SW620-shhCLOCK较SW620-Vec细胞凋亡增多(P<0.05):3.SW480-hCLOCK较SW480-Vec穿过聚碳酸酯膜细胞数明显增多;SW620-shhCLOCK较SW620-Vec穿过聚碳酸酯膜细胞数明显减少(P<0.01);4.VEGF、HIF-1α、ARNT蛋白表达在SW480-hCLOCK较SW480-Vec中明显增高(P<0.01);在SW620-shhCLOCK较SW620-Vec中降低(P<0.01);5.促凋亡基因BAX、BID蛋白表达在SW480-hCLOCK较SW480-Vec中降低(P<0.05);而抗凋亡因子P-AKT蛋白在SW480-hCLOCK较SW480-Vec中表达增高,在SW620-shhCLOCK较SW620-Vec中表达降低(P<0.01)。结论1.hCLOCK抑制结直肠肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、浸润及转移;2.hCLOCK通过促进结直肠肿瘤中VEGF、HIF-1α、ARNT等基因的表达及功能活性,从而促进肿瘤中微血管新生,作用于结直肠肿瘤的浸润、侵袭及转移等进展过程;3.hCLOCK通过促进抗凋亡基因P-AKT的表达及活性,同时抑制促凋亡基因BAX及BID的表达及活性,从而抑制肿瘤细胞的凋亡过程。
【作者】王雅平;
【导师】陈宗祐;华鲁纯;
【作者基本信息】复旦大学,外科学,2013,博士
【关键词】结直肠肿瘤;生物钟基因hCLOCK;血管内皮生长因子;细胞凋亡;

【参考文献】
[1]袁倩倩.二穗短柄草WRKY基因的表达分析及与MAPK的互作研究[D].华中科技大学,制药工程,2013,硕士.
[2]靳明.洱海流域海菜花—螺蛳湿地对农田低污染水净化研究[D].中国地质大学(北京),环境科学与工程,2014,硕士.
[3]张辉.大学生思想、政治、品德素质测试指标体系的研究[D].东北师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2003,硕士.
[4]赵雪松.四溴二苯醚与高氯酸盐对斑马鱼复合作用与毒性机制[D].哈尔滨工业大学,2013.
[5]辛培.“技”与“艺”[D].中央美术学院,美术学,2013,硕士.
[6]王雷.石墨烯三维复合材料的制备及其微波吸收性能研究[D].西北工业大学,2014.
[7]周飞燕.基于粗糙集与神经网络的多聚焦图像处理技术研究[D].北京印刷学院,信号与信息处理,2013,硕士.
[8]覃业宏,唐超,张春小,孟利军,钟建新.硅晶体表面石墨烯褶皱形貌的分子动力学模拟研究[J].物理学报,2015,01:271-277.
[9]张政,谢灼利.流体-固体两相流的数值模拟[J].化工学报,2001,01:1-12.
[10]闭书文.重症手足口病中枢神经系统免疫细胞的分布、数量及意义[D].广西医科大学,病理学与病理生理学,2013,硕士.
[11]付晓慧.顺应理论视角下访谈节目中闪避回答的研究[D].山西师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[12]李海方.β-D-半乳糖苷酶酶学性质及制备高纯度低聚半乳糖关键工艺的研究[D].江南大学,食品科学,2012,硕士.
[13]董知真.总承包采购信息管理系统设计与实现[D].大连理工大学,软件工程(专业学位),2012,硕士.
[14]张畅斌.膜分离技术文献计量学研究[J].江苏科技信息,2014,19:16-18+20.
[15]潘红华,胡家升,张圣云,汪德虎.基于灰色系统模型的预测函数控制方法研究[J].控制与决策,2004,01:117-119.
[16]任瑞静.排序集抽样下中位数的估计[D].华中师范大学,概率论与数理统计,2014,硕士.
[17]张沙沙.财产保全担保与担保物权冲突及对策问题研究[D].大连海事大学,法律,2014,硕士.
[18]韩萃清.美国特别诉讼委员会对股东代表诉讼的作用和影响[D].复旦大学,法律,2012,硕士.
[19]国兴.基于分形理论的图像压缩方法研究[D].大连理工大学,生物医学工程,2013,硕士.
[20]常雪凌.我国寿险公司股权结构与效率关系研究[D].厦门大学,保险学,2014,硕士.
[21]丁海山,毛剑琴,林岩.基于模糊树模型的自适应直接逆控制[J].自动化学报,2008,05:574-580.
[22]彭晓春.英汉委婉语的比较研究[D].华南师范大学,英语语言文学,2003,硕士.
[23]刘永佳.静电纺丝法制备系列玉米醇溶蛋白纳米纤维及性能研究[D].吉林大学,服装设计与工程,2014,硕士.
[24]武传鹏.现代化进程中的农村征地群体性事件研究[D].兰州大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[25]杜雷.基于概率的连续体结构拓扑优化设计[D].西安电子科技大学,机械制造及其自动化,2004,硕士.
[26]刘星.论促进我国商业银行中间业务创新的对策[D].首都经济贸易大学,金融(专业学位),2013,硕士.
[27]王小荣.基于评价理论的外交演讲分析[D].山西师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[28]封静.感戴团体辅导对大学生感戴及亲社会行为的影响研究[D].华中师范大学,心理健康教育,2014,硕士.
[29]王林娜.结节性硬化症TSC1、TSC2基因突变分析及其与临床表现的关系[D].郑州大学,儿内科,2013,硕士.
[30]王军良,俞景译,张安平,林春绵.环糊精调控对映体选择性的研究进展[J].理化检验(化学分册),2014,01:140-144.
[31]贺旸.赵孟頫美学思想探微[D].首都师范大学,美学,2014,硕士.
[32]郝晓俊.文化导入对英语学习者能力影响的实证研究[D].山西师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[33]王耀文.聚苯胺与石墨烯在防腐涂料中的应用[D].哈尔滨工程大学,2012.
[34]董国防.电网调度可视化系统的研究[D].华北电力大学(河北),电气工程,2004,硕士.
[35]孙德萌.山东省青少年男子排球运动员成长规律的研究[D].曲阜师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[36]倪哲明,付晓微,王巧巧,姚萍,刘晓明.水滑石焙烧产物对酸性黄49的吸附(英文)[J].稀有金属材料与工程,2012,S3:650-654.
[37]罗志华.有问题中小金融机构风险处置及其制度研究[D].湖南大学,金融学,2003,硕士.
[38]耿志刚.石墨烯复合结构的吸附和电催化性能研究[D].中国科学技术大学,2013.
[39]赵春楠.年龄相关生物标志物的联合检测推测生物学年龄的价值及其临床应用研究[D].苏州大学,临床检验诊断学,2014,硕士.
[40]刘洪艳,王万军.基于粗糙集的数据挖掘[J].甘肃教育学院学报(自然科学版),2002,03:17-20.
[41]邵乐.脑健胶囊对局灶性脑缺血后大鼠趋化因子MCP-1、MIP-1α表达的影响[D].湖南中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[42]李骞.CT增强及容积灌注成像在兔肝VX2肿瘤射频消融早期评价中的应用研究[D].华中科技大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[43]李勇.基于动态隔离策略的蠕虫传播模型研究[D].东北大学,计算机系统结构,2010,硕士.
[44]陈培.公益广告和商业广告中情态的对比分析[D].长安大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[45]杨海青.南太行山低山丘陵区主要灌木林生态服务功能及可持续经营研究[D].河南农业大学,森林培育,2013,博士.
[46]赵磊,李媛媛,李金超,赵晓坤.基于数据挖掘技术的电力日负荷优选组合预测[J].华北电力大学学报,2005,03:19-22.
[47]李元金,杨连贺.数据挖掘技术在汽车保险业中的应用[J].仪器仪表用户,2005,03:80-81.
[48]沈欣炜,郑竞宏,朱守真,朱凌志,施涛,曲立楠.光伏并网逆变器控制参数的dq轴解耦辨识策略[J].电力系统自动化,2014,04:38-43.
[49]王小姣.中日大学日语教育比较[D].南京师范大学,日语语言文学,2012,硕士.
[50]陈乔.建筑工程建设过程碳排放计算方法研究[D].长安大学,技术经济及管理,2014,硕士.

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