微小隐孢子虫TRAP-C2和TSP9蛋白的定位及其粘附功能研究

【摘要】微小隐孢子虫是机会致病性原虫，在兽医公共卫生上具有重要意义，对于免疫缺陷的个体(如艾滋病人)可导致严重腹泻甚至威胁生命。在发展中国家，微小隐孢子虫的感染是导致营养不良的体弱人群严重腹泻甚至死亡的重要因素。我们要探究控制微小隐孢子病的免疫学方法，首先就是要找出可以中和虫体感染阶段子孢子表面抗原的抗体，那么揭示微小隐孢子虫入侵宿主细胞的分子机制就有非常重要的研究意义。目前已经证实了多种微小隐孢子虫保守蛋白与虫体粘附及入侵宿主细胞有关，并发现这些蛋白在结构域、表达时期等方面存在许多共同点。为了发现更多的微小隐孢子虫粘附相关蛋白，本研究中选取了包含功能结构域而尚未被确认其功能的TRAP-C2和TSP9基因进行初步研究。本研究从微小隐孢子虫基因库中选取TRAP-C2中的两个基因片段和TSP9中的一个基因片段进行原核表达。首先根据微小隐孢子虫基因数据库中的TRAP-C2和TSP9目的片段的基因序列设计引物，然后进行PCR扩增，扩增得到的目的基因片段TRAP-C2-1、TRAP-C2-2和TSP9大小分别为933bp、909bp和1314bp。回收目的片段后将其连接至克隆载体pMD18-T，然后对重组克隆质粒进行酶切鉴定及测序，结果正确后将目的片段连接至表达载体pET-28a和pGEX-4T-1，然后对重组表达载体进行鉴定及测序比对。重组表达质粒构建完成后进行原核表达，通过亲和层析法纯化TRAP-C2-1-His、TRAP-C2-1-GST、TRAP-C2-2-His、TRAP-C2-2-GST、TSP9-His和TSP9-GST六种重组蛋白，然后通过SDS-PAGE和Westernblot检测鉴定。以上所有重组蛋白条带位置都符合预期分子量大小，并且其浓度及纯度较高，可用于后续实验。纯化出的His标签重组蛋白通过免疫家兔制备抗血清并纯化出多克隆抗体后，利用间接免疫荧光的方法将重组蛋白与被定位于微小隐孢子虫子孢子顶端的gp900蛋白进行共定位。本研究还分别用Westernblot、ELISA和间接免疫荧光方法检测了GST标签重组蛋白与HCT-8细胞(人盲肠上皮细胞)的结合，同时设置GST蛋白与HCT-8细胞孵育的对照组，初步研究了重组蛋白对HCT-8细胞的粘附作用，并且通过抗体体外阻断入侵试验进一步对其细胞粘附性结果进行验证。对蛋白的定位发现，本研究中三种蛋白质均表达在微小隐孢子虫子孢子中上部。细胞粘附试验中Westernblot检测、间接免疫荧光检测及抗体体外阻断入侵试验结果表明三种重组蛋白均可以与HCT-8细胞结合，而对照组GST蛋白则不能与HCT-8细胞结合。由此成功证实了本研究中重组蛋白质CpTRAP-C2-1、CpTRAP-C2-2、CpTSP9均可以结合在HCT-8细胞表面，参与了微小隐孢子虫粘附HCT-8细胞的过程。综合上述结果我们可以推测本研究中三种蛋白质都参与了微小隐孢子虫粘附宿主细胞的过程，并很可能在此过程中发挥了重要的作用。
【作者】韩福松；
【导师】尹继刚；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】微小隐孢子虫；共定位；细胞粘附；

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