GDSL家族嗜热酯酶EstL5的结构与功能研究

【摘要】酯酶是一类可催化酯类水解生成相应酸和醇,或催化酸和醇缩合生成酯类的酶,它们在生命过程中发挥着重要的作用,同时在工业生产中拥有良好的应用前景。本研究首次报道一个来源于GeobacillusthermodenitrificansT2的中度嗜热酯酶,EstL5,它是GDSL家族酯酶的新成员,更进一步的序列分析可将之归入SGNH亚家族。经过克隆、表达、纯化,我们获得了融合6His标签的重组EstL5蛋白。酶活检测发现,它的最适底物是短碳链羧酸酯类,对丁酸对硝基苯酯表现出最高的活性,对短链的甘油三酯类底物有较弱活性,同时对所有长链酯类不具任何活性。因此将EstL5定义为酯酶(esterase)而非脂酶(lipase)。另外没有检测到EstL5有硫酯酶或是磷脂酶的活性。理化性质测定结果显示,EstL5的最适反应温度为60℃,最适反应pH值为8.0；在0℃条件下仍有24%的酶活力；且在55℃保存12小时后保留100%的活性。EstL5可在多种有机溶剂和化合物环境中保持稳定。这些理化性质表明该酯酶具有较好的稳定性和宽泛的反应温度,为该酶的广泛应用提供了基础。表达纯化了硒代EstL5,通过气相悬滴扩散法获得了晶体。收集了分辨率为3.0A的衍射数据,晶体的空间群为P43212,单个晶胞参数为a=b=101.48A,c=124.56A。通过单波长反常散射法确定了相位,并完成了硒代EstL5的结构解析。获得分辨率为2.79A的野生型EstL5的晶体,并以硒代晶体结构为模板通过分子取代法完成结构解析。经比较发现野生型EstL5与硒代EstL5的晶体结构几乎没有差别。EstL5的结构显示在其中心区域拥有5个平行的β折叠片,它们的两侧分别覆盖有a螺旋结构,结构特征与SGNH家族酯酶的典型结构特征相吻合。序列分析和结构信息显示,EstL5的催化三联体由Asp235和His238组成,其中负责亲核攻击的Ser63位于一个p折叠和一个α螺旋的连接处,而Asp235、His238位于靠近C末端的两个螺旋间的柔性环上,它们的空间位置非常接近。EstL5的“氧孔”结构由Ser63、Gly101、Asn133组成,它们互相之间的距离约在3.5A至6A范围内,属于松散型“氧孔”。单突变结果显示催化三联体和“氧孔”结构中任何一个氨基酸残基的突变都会极大地影响EstL5的活性。可推定催化三联体Ser-Asp-His对EstL5的酯酶活性起到关键作用,并且‘氧孔’理论可用于解释其催化机制,“氧孔”形成的适宜的静电环境对催化过程起着重要作用。本论文主要对EstL5的结构功能进行了研究。首次报道并克隆表达纯化了EstL5,测定了它的基本理化性质,解析了它的晶体结构,阐述了它的催化机制。这为EstL5将来进入应用领域打下了基础,同时也为将来EstL5的同源酯酶家族的研究提供有益的帮助。
【作者】杨振兴；
【导师】季朝能；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2012，博士
【关键词】酯酶；嗜热菌；EstL5；酶学活性；硒代；晶体结构；催化三联体；“氧孔”；

【参考文献】
[1]邓高涛.一种QP钢的动态压缩与拉伸特性研究[D].宁波大学,工程力学,2012,硕士.
[2]吕靖.不完整数据集成分类算法的研究[D].安徽大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[3]魏丹.遗传算法在AHP权值确定中的应用研究[D].东北大学,系统工程,2011,硕士.
[4]陈红梅.共犯关系脱离理论及其司法适用[D].苏州大学,刑法学,2014,硕士.
[5]许晔.医药购销领域的商业贿赂行为法律规制研究及治理机制探究[D].上海交通大学,法律,2013,硕士.
[6]许经宇.岩质边坡喷锚支护在老龙口水利枢纽工程中的应用[D].大连理工大学,水利工程（专业学位）,2012,硕士.
[7]何其恩.XBRL财务报告的相关审计研究[D].兰州理工大学,会计学,2012,硕士.
[8]车芳芳.婚内侵权民事责任探讨[D].河北大学,民商法学,2014,硕士.
[9]齐伟,苏党生.纳米碳材料和高性能催化[J].化学反应工程与工艺,2013,05:423-429.
[10]张潇.基于跨层方法的异构网络智能网关优化算法研究[D].河南科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[11]晏创业,张玉峰.智能检索中的网络数据挖掘技术探索[J].中国图书馆学报,2002,03:48-50.
[12]李渭华,萧德云,方崇智.基于δ算子的格形故障检测滤波器[J].自动化学报,1994,04:413-419.
[13]杨丹丹.论新浪微博热门话题的传播[D].东北师范大学,传播学,2012,硕士.
[14]穆文忠.面向物流配送领域的个性化推荐系统设计与实现[D].哈尔滨工业大学,计算机技术,2014,硕士.
[15]荆龙.鼠笼式异步风力发电机的优化控制[D].北京交通大学,2008.
[16]唐明杰.钻井泥浆固化处置对地下水环境的影响分析[D].西南交通大学,环境工程,2013,硕士.
[17]董阳.多协议标签交换中RSVP-TE协议的研究与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[18]耿彦秋.现代汉语新兴类词缀研究[D].吉林大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[19]李世传.金银花叶抑菌活性成分的提取与筛选[D].江西农业大学,食品加工与安全（专业学位）,2013,硕士.
[20]郭昆.基于信息融合的列车悬挂系统故障分离研究与列车安全评价[D].北京交通大学,2014.
[21]宋海明.栗山天牛的食用安全性及其加工技术研究[D].吉林农业大学,农产品加工及贮藏工程,2012,硕士.
[22]黄晓春.应用射频超声血管测量技术评价脑小血管病患者颈动脉结构及功能[D].山西医科大学,影像医学与核医学（专业学位）,2013,硕士.
[23]朱艳.亚桥软件人员流失原因分析与对策研究[D].西安理工大学,工商管理,2004,硕士.
[24]丁森.不可展曲面近似展开中若干问题的研究[D].东北大学,机械设计及理论,2011,硕士.
[25]张晋疆.闭环多通道数字变换测试装置设计与实现[D].中北大学,电路与系统,2014,硕士.
[26]张金晶.预应力FRP管混凝土柱偏压力学性能研究[D].东北石油大学,结构工程,2013,硕士.
[27]谢华.一体化关联规则挖掘体系[D].南京航空航天大学,2005.
[28]许哲.基于GPS定位的矿石堆场机群监控系统设计[D].北京交通大学,2014.
[29]陈海斌.水泥行业废旧除尘布袋焚烧处理及其灰渣的利用[D].广东工业大学,环境工程,2013,硕士.
[30]孙海源.房地产新闻报道策略研究[D].河北大学,新闻与传播,2014,硕士.
[31]李鹏勃.基于ARM的智能车控制系统开发研究[D].兰州理工大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[32]孙文华.企业经营失败影响因素分析及规避策略研究[D].山东大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[33]徐俊丽.农业结构优化决策支持系统研究[D].山东师范大学,2002.
[34]刘大伟.基于立体视觉的三维重建方法研究[D].浙江工业大学,控制理论与控制工程,2011,硕士.
[35]刘锦斌.石墨烯的非共价生物分子修饰用于自组装构造纳米杂化结构的研究[D].中国科学技术大学,2010.
[36]陈桂芳.克莱恩对现代人困境的关切[D].广东外语外贸大学,英语语言文学,2013,硕士.
[37]FrancesDanielleDullaCong.中国—东盟自由贸易协定对菲律宾农产品出口的影响及对策[D].宁波大学,BusinessAdministration（专业学位）,2012,硕士.
[38]曾玲.螺旋离心泵内气固液三相非定常流动的数值计算与分析[D].兰州理工大学,流体机械及工程,2013,硕士.
[39]张晓粉.靶式撞击流喷嘴雾化特性实验及其数值模拟研究[D].西安工程大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2012,硕士.
[40]晏霞.深海宏基因组克隆子次生代谢产物的研究[D].厦门大学,药物化学,2014,硕士.
[41]吴立胜.生长抑素类似物奥曲肽抑制体外培养人胆管癌细胞生长及其可能机制的实验研究[D].安徽医科大学,外科学,2004,硕士.
[42]张玉祥.乡村旅游与新农村建设耦合模型及实证研究[D].浙江工商大学,旅游管理,2013,硕士.
[43]王卓艺.国际化战略、吸收能力对企业创新绩效的影响研究[D].吉林大学,国际贸易学,2014,硕士.
[44]刘威.基于码书模型的动态背景建模及前景目标检测[D].天津大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[45]王红红.城市流浪乞讨人员社会救助制度研究[D].苏州大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[46]高晓阳.甘肃河西大麦麦芽干燥控制系统研究[D].甘肃农业大学,2010.
[47]侯哲生,龚秋明,孙卓恒.锦屏二级水电站深埋完整大理岩基本破坏方式及其发生机制[J].岩石力学与工程学报,2011,04:727-732.
[48]谢美蓉.论张洁小说的女性形象与女性意识[D].江西师范大学,中国现当代文学,2004,硕士.
[49]刘潇萌.基于汉语作为第二语言教学的惯用语研究[D].沈阳师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[50]杨君,蒋健,王军淋,王晓晴,郑晓,潘再法,王丽丽.超声辅助液液萃取-气相色谱-质谱指纹图谱应用于烟用香精香料的检测[J].理化检验(化学分册),2012,05:559-562.