人源化抗CD20单克隆抗体理化性质和初步结晶研究

【摘要】研究目的：利妥昔单克隆抗体药（通用名，国际非专利药品名称：Rituximab）是由罗氏Roche制药厂所生产的一种作用于人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体，是全球首个被批准临床的用于治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）的单克隆抗体药物。由于CD20主要表现于B淋巴球细胞表面，因此该制品可用来治疗因B淋巴球过多所造成的疾病，包括淋巴癌、白血病、移殖排斥和某些自体免疫疾病；目前，该制品已经通过中国食品药品监督管理局（SFDA）批准并进入中国市场（商品名：美罗华），在其临床实践中，该单抗显示出较好的疗效和安全性；但在实际应用过程中也发现了一些的问题，如部分患者对利妥昔单抗的治疗并不产生临床反应；部分患者单独使用该药时，临床治愈率非常低；部分经临床治疗有效的患者，停药后会很快出现病情复发或进展，或者再次使用时产生治疗抵抗现象[1]。针对这些现象，开发人源化的抗CD20单克隆抗体药物就显得尤为重要。本文通过将获得的人源化抗CD20单克隆抗体对照品原液和抗体样品原液进行再纯化，配制成适宜的浓度，鉴定和比较二者的紫外吸收光谱、肽图、轻重链分子量、等电点、电荷异质体含量等结构信息；检测并比较二者的蛋白质纯度、ProteinA残留（ELISA）和CHO细胞蛋白残留（ELISA）等质量信息。在此基础上，对两种抗体样品进行初步结晶条件探索。研究方法：将抗体对照品和抗体样品再纯化、配制、分装和标定后，用SEC-HPLC法和非还原型SDS-PAGE法检测抗体样品和对照品的纯度；还原SDS-PAGE法检测抗体对照品和样品的纯度和轻重链分子量；CEX-HPLC法分析抗体样品和对照品的电荷异质体含量；cIEF法测定抗体样品和对照品的等电点；比较抗体样品和对照品的紫外吸收光谱；RP-HPLC分析抗体样品和对照品的肽谱图；ELISA法检测抗体样品和对照品的CHO细胞蛋白残留量；ELISA法检测抗体样品和对照品的ProteinA残留量；在这些质量和结构信息的基础上，对抗体样品和对照品的初步结晶条件进行探索及X-Ray分析。研究结果：抗体样品和抗体对照品经SPSepharoseFF阳离子层析后，蛋白质含量分别为16.1mg/ml和16.3mg/ml；配制后每种抗体蛋白均稀释为1.0mg/ml和10mg/ml两种规格；SEC-HPLC法检测抗体样品和对照品的纯度分别为99.2%和99.3%；还原SDS-PAGE法检测抗体样品和对照品的纯度和轻重链分子量结果显示，二者具有一致性，轻重链分子量分别为58kD和27kD，与理论值相吻合；CEX-HPLC法分析抗体样品和对照品的电荷异质体含量显示，二者均呈现良好的电荷均一性，达到蛋白质结晶的要求；非还原SDS-PAGE法检测抗体样品和对照品的纯度结果显示，二者纯度均达到100%，分子量约为135kD，二者呈现一致性；通过精确的cIEF法测定抗体样品和对照品的等电点，结果显示二者的等电点分别为9.23和9.20，考虑到系统误差，二者呈现一致性，与理论值相符；通过对抗体样品和对照品进行紫外吸收光谱分析，结果表明，二者最大紫外吸收波长均为277nm，在理论值范围内；通过RP-HPLC分析抗体样品和对照品的肽谱图，结果显示，二者的肽图具有一致性；ELISA法检测抗体样品和对照品的CHO细胞蛋白残留量，结果表明，二者均未检出残留宿主蛋白，适合进行蛋白质结晶；ELISA法检测抗体样品和对照品的ProteinA残留量，结果显示，二者均未检出残留蛋白A，适合进行蛋白质结晶；抗体样品和对照品的初步结晶条件探索，结果显示，发现一种初步结晶条件，晶体均为孪晶，经X-Ray分析表明，晶体为蛋白质，分辨率约为8左右，无法收集晶体的X-Ray衍射信息。研究结论：鉴定并比较人源化抗CD20单克隆抗体对照品和样品的质量和结构，结构鉴定和分析结果显示，二者具有一致性并与理论值相吻合；质量检测结果表明二者达到蛋白质结晶的质量要求；在此基础上对二者进行了初步结晶条件探索，成功获得了孪晶，为今后的结晶条件优化和从结构上研究该抗体的功能和作用机制奠定了基础，也为该人源化单克隆抗体在药学和临床医学应用开辟了新的研究思路。
【作者】何睦；
【导师】王志武；
【作者基本信息】吉林大学，卫生毒理学，2014，硕士
【关键词】人源化单克隆抗体；蛋白质结晶；CD20；电荷异质体；等电点；

【参考文献】
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