组蛋白去乙酰化酶参与斑马鱼后部侧线系统的早期发育以及内耳前体细胞的分化过程

【摘要】内耳毛细胞的损伤丢失所导致的耳聋是感音神经性聋的主要原因。哺乳类动物内耳毛细胞受损后不具备自我修复和再生能力,故由毛细胞变性坏死所引发的耳聋是不可治愈的。但在某些鱼类和两栖类动物中的毛细胞损伤丢失后可以继续增殖,从而自发生成新的毛细胞,可用于毛细胞再生的研究。斑马鱼因与人类有很高的同源性,发育周期短等优点备受关注。因胚胎身体透明,方便构建各种荧光标记的转基因斑马鱼,用于活细胞成像观察(liveimaging)这些基因的表达模式。斑马鱼侧线器毛细胞在结构和功能上与哺乳类动物内耳毛细胞类似,且因侧线器位于体表,使得毛细胞易于被观察检测。上述优势使得斑马鱼成为研究毛细胞发育及再生的较为理想的模式生物。侧线系统(laterallinesystem,LL)作为鱼类和两栖类特有的感觉器官,具有感知水流、水压和听觉等功能。它由多个位于体表的神经丘(neuromast)细胞为单位组成。侧线系统根据分布排列的位置分为前部侧线系统(Anteriorlaterallinesystem,ALL)和后部侧线系统(Posteriorlaterallinesystem,PLL),前者包括头部的神经丘细胞,后者包括躯干和尾部的神经丘细胞。侧线神经丘细胞的基本结构单位是由位于神经丘中央的毛细胞(HairCell,HC)以及位于周边的支持细胞(SupportingCell,SC)所构成。近年来国内外学者对侧线系统的结构功能及器官发育等方面均展开了广泛系统的研究。组蛋白的乙酰化／去乙酰化修饰是调控基因转录的重要机制之一,在细胞增殖、分化、凋亡以及细胞周期等生物过程中发挥着重要的调控作用。组蛋白的乙酰化主要与基因转录的激活相关,组蛋白的去乙酰化则主要与基因沉默有关。组蛋白的乙酰化修饰是由组蛋白乙酰化转移酶(histoneacetyltransferases,HATs)与组蛋白去乙酰化转移酶(histonedeacetylases,HDACs)的动态平衡来维持的。组蛋白乙酰化／去乙酰化修饰在胚胎发育、多种器官和系统的形态发生等生物学过程中起着重要作用。近年的研究表明组蛋白去乙酰化修饰与神经干细胞的分化关系密切,组蛋白去乙酰化转移酶影响神经前体细胞的分化方向。但关于乙酰化／去乙酰化修饰在听觉系统的发生发育等一系列生理学以及病理学过程中的作用的研究并不多见。有研究表明组蛋白去乙酰化修饰与内耳感觉上皮支持细胞的分裂增殖有密切关系。组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂对鸡椭圆囊感觉上皮支持细胞的再生性增殖有抑制作用。然而组蛋白去乙酰化修饰在斑马鱼侧线器早期发育以及神经丘毛细胞分化过程中发挥何种作用目前尚不清楚。我们首先以斑马鱼为模型观察组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂对斑马鱼后部侧线系统发育的影响。重点研究HDACs在斑马鱼侧线原基的迁徙,神经丘的沉积以及侧线神经丘毛细胞的分化这三个过程中的作用,为今后研究鱼类后部侧线系统发育的分子机制提供了一种新的结合点。最后我们观察HDACs对哺乳动物内耳前体细胞定向分化的影响,将组蛋白修饰与内耳前体细胞定向分化联系起来,为治疗感音神经性聋提供了一种新的思路。第一部分组蛋白去乙酰化酶参与斑马鱼后部侧线原基迁徙以及神经丘沉积过程目的研究组蛋白去乙酰化酶对斑马鱼后部侧线原基(posteriorlaterallineprimordium)迁徙以及神经丘沉积的影响。材料与方法选择6hpf的斑马鱼胚胎,分别用不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸盐(VPA)、曲古菌素A(TSA)处理胚胎,用DAPI对细胞核进行染色,在荧光显微镜下观察斑马鱼后部侧线原基的迁徙以及神经丘的沉积情况。合成地高辛标记的cxcr7b反义RNA探针,进行斑马鱼全标本包埋的RNA原位杂交,研究cxcr7bmRNA在原基迁移过程中的表达情况。BrdU标记增殖细胞,观察原基细胞团的增殖情况。使用蛋白质印迹(WesternBlot)方法检测斑马鱼整体胚胎组蛋白H3和H4的乙酰化水平。结果1.VPA的处理对斑马鱼胚胎的形态、存活率、孵出率以及行为学等方面均有影响。表现为随着药物浓度增加,身体畸形率增高、胚胎的孵出率和存活率均下降,高浓度VPA(200μM)处理6hpf胚胎持续至3dpf时,死亡率高达20%,药物持续处理至5dpf时,胚胎基本全部死亡。VPA处理组亦有明显的行为学改变,表现为以头部为轴的风车式转动以及异常的逃脱反应。蛋白质印迹检测表明VPA处理组的AceH3和AceH4蛋白水平增高；2.VPA和TSA处理6hpf斑马鱼胚胎,发现药物干扰后部侧线系统(PLL)的早期发育,表现为延缓原基迁徙速度,且呈浓度依赖性。cxcr7b的原位杂交结果进一步证实了该作用；3.VPA和TSA处理组的侧线神经丘的空间分布异常,表现为处理组较对照组神经丘所沉积的肌节位置滞后,尤其是躯干部第一个侧线神经丘(L1)的沉积位置显著延后,且与药物浓度呈正相关；4.免疫荧光染色分析原基细胞的增殖情况,结果显示VPA和TSA处理组的原基细胞团BrdU阳性细胞数目较对照组明显减少。结论1.VPA的处理对斑马鱼胚胎的形态,存活率、孵出率以及行为学等方面均有影响；2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理延缓斑马鱼后部侧线原基的迁徙速度；3.组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理影响斑马鱼后部侧线神经丘的沉积过程,改变其空间分布；4.组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理对原基细胞团有增殖抑制作用。第二部分组蛋白去乙酰化酶参与斑马鱼侧线神经丘毛细胞的早期发育目的研究组蛋白去乙酰化酶对斑马鱼后部侧线神经丘毛细胞的分化以及神经丘细胞增殖的影响。材料与方法选择3dpf的AB品系以及Brm-GFP转基因斑马鱼胚胎,分别用不同浓度的VPA(50,100,150μM),TSA(0.05、0.1、0.2μM)以及MS-275(5,10,15μM)处理胚胎发育至5dpf或7dpfo以MyosinVI以及GFP标记和辨别已分化的毛细胞,活细胞染料FM1-43FX标记有功能的毛细胞,BrdU标记增殖细胞,TUNEL和cleavedcaspase-3染色标记凋亡细胞,在荧光显微镜以及激光共聚焦显微镜下观察药物处理对神经丘细胞的增殖、凋亡及毛细胞分化情况的影响。使用免疫荧光染色和蛋白质印迹(WesternBlot)方法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对斑马鱼胚胎组蛋白H3、H4、H3K9、H3K14、H4K5和H4K12的乙酰化水平的影响。结果1.组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂的处理致使神经丘毛细胞数目减少,并呈剂量依赖性关系。同时使用活细胞染料FM1-43FX标记毛细胞,结果表明抑制剂的处理亦导致有功能的毛细胞数目减少。免疫荧光染色和WesternBlot检测的结果均显示抑制剂处理组的组蛋白H3、H4、H3K9、H3K14H、4K5和H4K12的乙酰化水平升高。2.BrdU标计增殖细胞,结果显示组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理组神经丘细胞团中BrdU阳性细胞数目明显减少。TSA(0.1pM)处理组神经丘中BrdU阳性细胞数为8.2±0.3(n=35),对照组BrdU阳性细胞数为11.6±0.3(n=45)(P<0.05)。VPA(100μM)处理组神经丘中BrdU阳性细胞数为8.1±0.3(n=35),对照组BrdU阳性细胞数为11.8±0.4(n=46)(P<0.05)。MS-275(10μM)处理组神经丘中BrdU阳性细胞数为6.8±0.3(n=32),对照组BrdU阳性细胞数为11.6±0.3(n=45)(P<0.05)。3.高浓度或长时间的TSA处理可诱导神经丘细胞凋亡。神经丘细胞可见TUNEL,cleavedcaspase-3阳性染色。结论1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂对斑马鱼侧线神经丘毛细胞的分化起抑制作用；2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂对斑马鱼侧线神经丘细胞有增殖抑制作用；3.组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导神经丘细胞凋亡呈剂量和时间依赖性。第三部分组蛋白去乙酰化酶参与新生小鼠内耳前体细胞的分化目的研究组蛋白去乙酰化酶在新生小鼠耳蜗高增殖前体细胞向感觉上皮尤其是毛细胞方向分化过程中的作用。材料与方法从新生(PO)ICR小鼠听泡内取得耳蜗基底膜组织,经酶解消化后,用10%胎牛血清培养液中止消化。离心收集单细胞悬液,无血清培养液重悬细胞沉淀进行悬浮培养。至第8天时收集悬浮细胞球进行贴壁培养。实验组给予TSA(0.1μM)处理,对照组给予DMSO处理,诱导分化1周后去除处理因素,继续使用无血清培养液培养1周。收集第8天的悬浮细胞球和贴壁培养14天的分化细胞,运用免疫荧光细胞化学技术检测神经巢蛋白(Nestin)、溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、Pax2,myosinVIIA和Sox2的表达；运用RT-PCR技术对内耳发育相关基因进行分析。结果内耳前体细胞向毛细胞方向分化时,给予TSA处理,结果观察到TSA处理组的myosinVIIA与Sox2阳性细胞数较对照组均明显减少。同时检测前体细胞的增殖能力,结果显示TSA处理组的BrdU阳性细胞数明显减少,且BrdU和myosinVIIA以及BrdU和Sox2的双标阳性率均显著低于对照组。RT-PCR结果亦表明TSA处理组的14天分化细胞中毛细胞的标志物(Math1、myosinVIIA)以及支持细胞标志物(p27kip1、Sox2)的mRNA表达水平均低于对照组。结论1.TSA的处理抑制内耳前体细胞向毛细胞和支持细胞分化；2.TSA对细胞球具有增殖抑制作用。
【作者】何英姿；
【导师】李华伟；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2012，博士
【关键词】斑马鱼；后部侧线系统；原基；神经丘；毛细胞；支持细胞；组蛋白去乙酰化前体细胞；耳蜗；细胞球；

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