绵羊equatorin（赤道素）的cDNA克隆、原核表达、抗体制备及在顶体反应前后精子中的定位

【摘要】哺乳动物的成功受精是动物的种族延续和基因进化的前提,精子与卵子的质膜粘附并融合是哺乳动物完成受精所必需的步骤。近年来,在很多学者利用现代分子生物学手段对精卵质膜粘附和融合过程进行的研究中发现,精卵融合是个多分子多受体的协调下共同参与发生的过程。现阶段普遍认为精卵融合的起始部位为精子膜赤道区,而对equatorin的研究起始于应用MN9单克隆抗体对精子上该蛋白的识别,而且体外注射MN9抗体能显著抑制精卵融合,初步猜想Eqtn为精卵融合相关蛋白。但是Eqtn究竟以何种方式参与顶体并最终介导精卵融合尚未知。本实验以内蒙古绵羊为实验动物,首先根据GenBank中已公布的相关物种Eqtn基因序列信息,对比其CDs区寻找保守序列,设计该基因的特异性引物。提取绵羊睾丸组织总RNA,通过反转录获得cDNA,以此为模板克隆Eqtn基因的cDNA,并测序。测序后,根据该cDNA的可参考序列,设计特异性引物克隆去掉信号肽后的基因片段(19aa-336aa)。将克隆得到的cDNA片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达质粒pGEX-Eqtn;将重组质粒PGEX-Eqtn转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,在最优的表达条件下,37℃,大量表达Eqtn蛋白4h；利用还原性谷光甘肽亲和纯化柱子过滤菌体表达产物的上清液,获得纯化的融合蛋白GST-Eqtno将获得的Eqtn纯化蛋白浓缩后,与弗氏佐剂等量混合制成抗原乳剂,皮下多点注射昆明雄性小鼠,每10天进行一次加强免疫。35天后注射S180腹水瘤细胞。当免疫小鼠的腹部明显鼓起后,收集腹水与血清中的多克隆抗体,利用间接Elasa法检测了抗体的效价。根据抗原与抗体的特异性的免疫反应,通过WesternBloting检测了该抗体对纯抗原蛋白GST-Eqtn以及绵羊睾丸组织蛋白的免疫特异性。经过检测合格的自制抗体即可用于之后的免疫组织化学检测。最后用自制的多克隆抗体分别对绵羊睾丸组织切片和顶体反应前后绵羊的精子细胞切片进行免疫组织化学染色,通过显色反应识别抗体anti-Eqtn与相应的抗原蛋白Eqtn的结合部位,检测到Eqtn分布在睾丸曲细精管中各类细胞中。而且在顶体反应前的精子中,Eqtn主要分布在顶体帽区域,在顶体反应之后,剩余的Eqtn会重新定位于精子的赤道区域。
【作者】裴媛媛；
【导师】邢万金；
【作者基本信息】内蒙古大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】绵羊；顶体反应；Eqtn；分子克隆；多克隆抗体；

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