肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子在骨关节炎形成机制中作用的实验研究

【摘要】背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是最常见的关节疾病之一,在老年人中发病率较高。主要表现为骨关节的慢性、退行性改变。在全世界范围内,OA的患病率居首位。在我国,随着人口老龄化日益加重,OA的发病率逐年上升。OA是力学和生物学因素作用下导致软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨降解与合成耦联失平衡所致。长期以来对于OA病因的研究侧重于生物力学的改变,因为单生物力学因素不能完全解释OA的发病机理,近几年侧重点有所改变,着重于酶学、炎性细胞因子和细胞凋亡等。现有的研究表明,OA的主要病理机制是在炎性细胞因子介导下,致病因素促进各种蛋白酶在关节软骨和滑膜中的表达增高,降解关节软骨基质中胶原纤维网和蛋白多糖,促使关节软骨的退行性改变。有很多炎性细胞因子及趋化因子等参与了蛋白酶的调控。其中最重要的是IL-1β和TNF-α,它们不仅在炎症反应过程中起主导作用,在OA中它们更主要的功能是上调基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)的表达,增加MMPs的活性。既然IL-1β和TNF-α在OA中扮演着重要的角色,能否通过抑制这两种因子来控制OA?但是临床试验结果显示,抑制IL-1β和TNF-α并没有在OA病人中出现理想的效果。我们认为这可能源于OA中存在更多的各种致病因子及它们之间复杂的相互作用,当然还包括许笺我们未知的因子。这些细胞因子相互协调,相互作用,刺激MMPs的合成与分泌,最后促进软骨组织的降解。肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumornecrosisfactor-likeweakinducerofapoptosis,TWEAK)是一种属TNF配体超家族成员(tumornecrosisfactorsuperfamily,TNFSF)的细胞因子,能微弱诱导肿瘤细胞凋亡而由此命名。更多研究发现,TWEAK可在多种细胞上表达,是一种多功能的细胞因子,它不仅可诱导细胞凋亡,而且具有促进炎性细胞因子和趋化因子分泌及细胞增生等生物学效庆,还能特异性抑制软骨形成,从而阻碍软骨的内源性修复。成纤维细胞生长因子诱导因子14(fibroblastgrowthfactorinducible14,Fn14)是一种TWEAK受体,广泛表达于多种组织,可通过连接不同的含有TNF受体相关因子(TNFreceptor-associatedfactor,TRAF)结构域的受体蛋白或胞浆蛋白,启动细胞内的一系列信号转导途径。证据表明,TWEAK是类似于IL-1β和TNF-α的多功能细胞因子,它是否也协同参与了关节软骨降解的演变过程?TWEAK及其受体Fn14是否也在OA中扮演了一定的角色?本研究拟通过大鼠OA模型检测TWEAK及其受体Fn14mRNA及蛋白在病变关节软骨及滑膜组织中的表达情况,及TWEAK对体外培养的软骨细胞和成纤维样滑膜细胞产生炎性细胞因子、趋化因子及基质金属蛋白酶的影响情况,拟对TWEAK及其受体Fn14在OA发病机制中的作用有初步的认识,为探索OA治疗新方案提供理论依据。第一部分大鼠骨关节炎模型的建立及评价目的制作大鼠膝关节OA模型,并进行大体及光镜下的观察及组织学评价,为后续实验做准备。材料与方法用前交叉韧带切断术(anteriorcruciateligamenttransaction,ACLT)制作大鼠膝关节OA模型,假手术组及正常组作为对照。在术后1周、2周及4周观察膝关节退变的大体改变,光镜下观察软骨的组织学改变,并用Mankin评分系统评分。结果不同时间段实验组膝关节大体及光镜下均观察到OA特征性的退行性改变,且随时间延长而逐渐加重,符合整个OA的病理发展过程,且代表了OA的早中期,有利于后续的分子生物学检测。结论我们用ACLT制作的大鼠膝关节OA模型,造模效果确切稳定,为后续实验的可靠性打好了基础。第二部分TWEAK及其受体Fn14在大鼠骨关节炎关节软骨和滑膜中的表达目的检测大鼠膝关节OA模型中软骨及滑膜组织TWEAK及其受体Fn14mRNA及蛋白的表达情况,及关节液中TWEAK的浓度变化。材料与方法制作大鼠膝关节OA模型,用假手术组及正常组作为对照。在术后第1周、第2周及第4周后收集软骨组织、滑膜组织及关节液。实时定量PCR(Real-timePCR)检测TWEAK及其受体Fn14mRNA的表达；蛋白质免疫印迹法(Western-blot)检测TWEAK及其受体Fn14蛋白的表达；酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测关节液中TWEAK的浓度变化。结果OA模型组滑膜组织中TWEAK及其受体Fn14mRNA和蛋白的表达在造模后第2及第4周均高于假手术组及正常对照组；OA模型组软骨组织中TWEAK及其受体Fn14mRNA和蛋白的表达在造模后第2周高于假手术组及正常对照组；OA模型组关节液中TWEAK的浓度在造模后第1周、第2周及第3周均高于假手术组及正常对照组。结论大鼠膝关节OA模型中,关节软骨及滑膜组织中TWEAK及其受体Fn14mRNA及蛋白的表达在病程的部分时段明显升高,且关节液中TWEAK的浓度也持续增高,它们与OA的病理过程有着紧密的关联。第三部分TWEAK对体外培养的软骨细胞和成纤维样滑膜细胞产生炎性细胞因子、趋化因子及基质金属蛋白酶的影响目的检测TWEAK对体外培养的软骨细胞和成纤维样滑膜细胞产生炎性细胞因子、趋化因子及基质金属蛋白酶的影响材料与方法使用Wistar大鼠,取正常关节软骨及滑膜组织,培养软骨细胞及成纤维样滑膜细胞并鉴定,使用TWEAK刺激软骨细胞及成纤维样滑膜细胞,收集刺激后24小时、48小时及72小时后的上清液,ELISA法测定上清液中的下列成份：①基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13):②炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)；③趋化因子(RANTES、MCP-1、MIP-2、IL-8).结果TWEAK刺激后软骨细胞和成纤维样滑膜细胞产生基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3、MMP-9)、炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和趋化因子(RANTES、MCP-1、IL-8)显著增加；但MIP-2的产生在两种细胞中均显著减少；MMP-13仅在软骨细胞中的产生显著增加,而在成纤维样滑膜细胞中无变化。且增加的程度大多与刺激的时间呈正相关,仅MIP-2呈负相关；但软骨细胞在TWEAK的刺激下,产生MCP-1、IL-8、MMP-3和MMP13的量没有随着时间的延长而增加；成纤维样滑膜细胞在TWEAK的刺激下,产生MMP-1和MMP13的量也没有随着时间的延长而增加。结论体外培养的大鼠软骨细胞和成纤维样滑膜细胞在TWEAK诱导下能增加部分炎性细胞因子、趋化因子基质金属蛋白酶的产生。
【作者】蔡国平；
【导师】俞永林；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】大鼠；动物模型；骨关节炎(OA)；前交叉韧带切断术(ACLT)；蛋白质印迹法(Western-blot)；酶联免疫吸附试验(ELISA)；Real-timePCR；基质金属蛋白酶(MMP)；趋化因子；细胞培养；

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