心室起搏诱导心肌适应减轻急性心梗后再灌注损伤的研究

【摘要】急性心肌梗死后梗死面积与梗死后心律失常、心力衰竭和死亡率明显相关,因此,急性心肌梗死治疗中减少心梗面积是重要的治疗目标。早期再灌注治疗是挽救心肌,减少心梗面积的有效方法。但再灌注治疗本身会导致心肌细胞的死亡和心肌收缩力的下降,对缺血心肌造成再次损伤。因此有效抑制或减轻再灌注损伤,可以进一步提高再灌注治疗的疗效,减少临床并发症,并进一步降低急性心梗死亡率。缺血适应定义为在心肌发生严重缺血之前、之后和缺血的同时给予心肌或其他脏器间断重复的再次缺血,可减轻再灌注的损伤,即缺血预适应、后适应、过程适应和远程适应具有保护再灌注损伤的作用。近年一个荷兰研究小组报道了心室起搏引起的心室收缩不同步在兔心和猪心也同样具有预适应和后适应的作用。我们的研究首先利用MetronicSelectSecure3830主动起搏电极和心房超速抑制起搏模式在新西兰兔和SD大鼠上成功建立在体右室心尖部起搏模型,并通过心电生理和心超证实了左室收缩的不同步。其次,我们以心室起搏30秒,间歇30秒作为一个起搏周期,分别在兔心和大鼠心上证实了右室心尖部20周期起搏预适应、10、20周期过程适应和20周期后适应能减轻Evans蓝和TTC双染色的心梗面积,其中20周期起搏预适应效果最佳,20周期过程适应优于10周期过程适应,而且发现起搏适应在减少心梗面积的同时伴相应心肌细胞凋亡率的下降。之后我们通过ELISA、Western印迹、qPCR等分子生物学技术,证实起搏诱导适应的分子水平机制为牵张作用下调PKC信号通路,降低炎症因子的表达,减少心肌细胞的凋亡,进而减少再灌注损伤。最后我们又在SD大鼠模型上发现起搏诱导的预适应、过程适应和后适应能减少心梗后长期(8周)的心肌纤维化、左室扩大和左室收缩功能的下降,并证实这一保护作用是通过下调AT1R-PKC-ERK信号通路,降低心肌纤维化,抑制心肌重构而改善左心收缩功能。综合以上研究成果,我们认为右心室心尖部起搏诱导的心室收缩不同步,能够在新西兰兔和SD大鼠两种动物模型上产生预适应、过程适应和后适应作用来保护心肌梗死后的再灌注损伤,其作用机制是通过牵张作用下调PKC信号通路,降低炎症因子的表达,减少心肌细胞的凋亡来实现,另外,起搏诱导的适应能通过下调AT1R-PKC-ERK信号通路,减少心梗后长期的心肌纤维化,抑制心肌重构而改善左心收缩功能。因此PKC信号通路可能在起搏诱导适应减少心肌细胞凋亡和心肌纤维化两方面都发挥重要作用。第一部分建立急性心肌梗死和再灌注损伤模型和在体右心室起搏模型目的：在新西兰兔和SD大鼠建立可靠的左室心梗和再灌注损伤和在体右心室心尖部起搏模型。方法：采用开胸结扎冠状动脉的方法分别在新西兰兔和SD大鼠建立左室心梗模型；12导联心电图检测新西兰兔和SD大鼠的心电活动；以30%硫酸钡主动脉逆行灌流离体SD大鼠心脏,活体成像系统X线摄片；SelectSecure3830主动起搏电极旋入新西兰兔或SD大鼠右室心尖部后与Metronic2090程控仪+2290分析仪相连接,以VOO模式高于自身心率20次／分夺获自身节律,建立在体右室心尖起搏模型,测量比较起搏前后QRS波群宽度,并在新西兰兔关胸后比较起搏前后经胸心超测量室间隔及左室后壁达最大收缩时间差异(SPWMD)和左室(右室)射血前时间间期(PEP)以及经颈动脉插入导管进入左心室测量左室压力和dp/dt的变化。结果：分别开胸在新西兰兔结扎左室支和在SD大鼠结扎前降支,12导联心电图可以看到ST-T动态改变和再灌注心律失常；成功获得SD大鼠冠状动脉造影图像,包括成功结扎前降支图像；分别在新西兰兔和SD大鼠建立在体右室心尖部起搏模型,起搏后QRS波明显较起搏前增宽；新西兰兔起搏前后比较SPWMD和PEP,结果SPWMD起搏前(20.02±8.32)msvs起搏后(78.80±26.57)(P=0.007,n=5)；PEP起搏前(14.40±5.86)ms,起搏后(-26.80±7.33)(P<0.001)；有创测定最大dp/dt起搏前(1072.82±154.85)mmHg/ms,起搏后(648.75±135.09)mmHg/ms(P<0.001),最小dp/dt起搏前(-989.49±100.51)mmHg/msvs起搏后(-547.57±148.11)mmHg/ms(P=0.002)。结论：结扎方式建立的新西兰兔和SD大鼠急性心梗和再灌注损伤模型是可靠的；以SelectSecure3830主动起搏电极建立的右室心尖部起搏模型是可靠的,心电生理和心超证实右室心尖部起搏存在左右心室和左室内收缩不同步,影响左室的收缩功能。第二部分心室收缩不同步诱导的心肌适应减轻兔急性心肌梗死后短期再灌注损伤的研究目的：探讨右室心尖部起搏造成的心室收缩不同步诱导的不同形式心肌适应能否减轻新西兰兔缺血再灌注心肌损伤。方法：新西兰兔开胸结扎左室支30分钟后再灌注210分钟建立急性心梗再灌注损伤模型,右室心尖部旋入SelectSecure3830主动起搏电极,60只新西兰兔分成5组,分别为假起搏组：不予起搏；过程适应10(Per10)组：左室支结扎20分钟后,以基础自身心率加20次/分作为起搏频率,10个30秒起搏周期,每个间隔30秒,之后松解结扎再灌注；后适应20(Post20)组：结扎30分钟后松解结扎即刻起搏20个周期后再灌注；过程适应20(Per20)组：结扎10分钟后起搏20个周期,之后松解再灌注；预适应20(Pre20)组：20个起搏后立即结扎左室支,30分钟后松解结扎再灌注。分别静脉取血测定开胸前和再灌注结束取材前的CK-MB,TNT、LDH、CRP、TNF-α、IFN-γ和IL-10。每组6-9只行Evans蓝和TTC双染色测定并计算梗死比值和缺血比值,每组另取5只取材后浸泡于10%福尔马林液固定,切片行HE染色、免疫组化Connexin43表达和TUNEL测定凋亡细胞比值。结果：1.5组的心脏比值和缺血百分比组间无差异。5组的梗死百分比组间有差异(χ2值83.85,P值<0.001),其中假起搏组(n=9)的梗死百分比最高达61.23%,干预组中Pre20组(n=7)和Per20组(n=6)梗死百分比最低,分别42.46%和41.03%,两组间统计学无差异,Post20组(n=7)梗死百分比为47.87%,高于Pre20组和Per20组但低于Per10组(n=6)50.90%,Per10组梗死百分比高于Per20组,均有统计学意义。2.5组的血清心肌酶,与基线相比较,包括血清CKMB、TNT和LDH水平,在左室支结扎30分钟再灌注210分钟后均明显升高,无论给予何种形式的起搏诱导的适应均降低再灌注后的心肌酶浓度,而Per20组和Pre20组更明显。3.心肌细胞凋亡率在5组组间存在统计学差异,P<0.001,在假起搏组达到82.42%,凋亡率最高,其次是Per10组和Post20组,分别是68.93%和69.04%,这两组间无统计学差异,Per20组和Pre20组最低,分别为62.85%和58.88%,两组间无统计学差异,但与其他三组间有统计学差异。4.各组在左室支结扎30分钟再灌注210分钟后血清CRP、TNF-α、IL-10和IFN-γ水平与基线相比均增高,与假起搏组相比,Per10组各炎性指标无差异,Post20组减轻TNF-α和IFN-γ水平,Per20组和Pre20组减轻CRP、TNF-α、IL-10和IFN-y水平。结论：1.右心室心尖部起搏诱导的心肌适应,包括预适应、过程适应和后适应均能减轻缺血再灌注心肌损伤；在所有这些起搏诱导适应的模式中,预适应减轻缺血再灌注心肌损伤的程度最明显,过程适应和后适应次之；20周期过程适应优于10周期过程适应,与预适应效果类似。2.起搏诱导的心肌适应使兔急性心肌梗死240分钟后心肌细胞的凋亡率明显下降,其中预适应和20周期的过程适应最明显,同时使包括CRP、TNF-α、IL-10和IFN-γ血清炎性因子水平也明显下降。3.起搏诱导的心肌适应作用可能是通过减少再灌注时炎性因子造成心肌细胞的凋亡来实现降低再灌注心肌损伤。第三部分摘要心室收缩不同步诱导的心肌适应减轻大鼠急性心肌梗死后再灌注损伤短期作用和机制的研究目的：探讨右室心尖部起搏诱导的心肌适应减轻大鼠急性心肌梗死后再灌注损伤短期作用和起搏适应的机制。方法：SD大鼠开胸结扎前降支30分钟后再灌注90分钟建立急性心梗再灌注损伤模型,右室心尖部旋入SelectSecure3830主动起搏电极。分成5组,分别为假起搏组：不予起搏；过程适应10(Per10)组：前降支结扎20分钟后,以基础自身心率加20次/分作为起搏频率,10个30秒起搏周期,每个间隔30秒,之后松解结扎再灌注；后适应20(Post20)组：结扎30分钟后松解结扎即刻起搏20个周期后再灌注；过程适应20(Per20)组：结扎10分钟后起搏20个周期,之后松解再灌注；预适应20(Pre20)组：20个起搏后立即结扎前降支,30分钟后松解结扎再灌注。分别静脉取血测定开胸前和再灌注结束取材前的CK-MB,TNT、LDH、CRP、TNF-、IFN-和IL-10。行Evans蓝和TTC双染色测量并计算梗死比值和缺血比值,另取每组5只行组织切片HE染色、免疫组化Connexin43表达和TUNEL测定凋亡细胞比值；抽取心肌组织RNA,检测IL12a、IL6R、IL8Ra和IL8Rb四个炎症相关基因以及FOS、HSPala和TGFbetal三个炎症因子转录活性相关基因的表达；WesternBlot法检测1.心肌组织PKC通路蛋白各亚型(pPKC、pPKC1、pPKC2和pPKC)与ERK的蛋白表达水平；2.反映炎症活性程度的pIB和pNFB及细胞内总IB和NFB的蛋白表达水平、3.AKT家族、Bcl-2家族和Survivin凋亡信号通路相关蛋白和Caspase3的蛋白表达。结果：1.5组的心脏比值和缺血百分比组间无差异。5组的梗死百分比组间有差异(χ2值=52.40,P值<0.001),其中假起搏组(n=7)的梗死百分比最高达48.21%,干预组中Per10组(n=6)、Post20组(n=7)、Per20组(n=6)和Pre20组(n=7)梗死百分比为分别37.07%、43.53%、27.71%和22.66%,组间均有统计学差异,Pre20组的梗死百分比最低。2.5组的血清心肌酶,与基线相比较,包括血清CKMB、TNT和LDH水平,在前降支结扎30分钟再灌注90分钟后均明显升高,无论给予何种形式的起搏诱导的适应均降低心梗后的心肌酶浓度,而Per20组最明显。3.心肌细胞凋亡率在5组组间存在统计学差异,P<0.001,在假起搏组达到58.92%,凋亡率最高,其次是Per10组和Post20组,分别是48.83%和49.57%,这两组间无统计学差异,Per20组和Pre20组最低,分别为40.73%和40.11%,两组间无统计学差异,但与其他三组间有统计学差异。4.各组在左室支结扎30分钟再灌注210分钟后血清CRP、TNF-α、IL-10和IFN-γ水平与基线相比均增高,与假起搏组相比,各干预组的炎性因子均有下降,统计学有差异,其中Pre20组所有炎性因子水平下降幅度最大。5.Connexin43表达在假起搏组出现明显紊乱,团块状聚集。而起搏干预组Cx43的分布紊乱程度减轻,其中Pre20组则更接近于正常的密度,呈短条带状分布于心肌细胞闰盘部位。6.起搏干预明显降低PKC各亚型的表达活性,并下调磷酸化ERK表达,其中Pre组表达降低最为明显(P<0.05)7.心肌适应干预组炎症因子IL12a、IL6R、IL8Ra和IL8Rb的表达均显著下调,进而三个转录水平相关基因FOS、HSPala和TGFbetal表达也显著下调。同时,炎症相关蛋白pIB和pNFB表达明显下调,而细胞内总IB和NFB的量保持恒定水平。8.干预组pAKT/AKT、Bcl-2/Bax和Survivin凋亡相关蛋白的表达显著升高,Caspase3的表达水平明显下调,其中表现最明显的是Pre20组,其次是Per20组。结论：1.右心室心尖部起搏诱导的心肌适应,包括预适应、过程适应和后适应均能减轻SD大鼠急性心肌梗死后再灌注心肌损伤；在所有这些起搏诱导适应的模式中,预适应减轻缺血再灌注心肌损伤的程度最明显,过程适应和后适应次之；20周期过程适应优于10周期过程适应,与预适应效果类似。2.起搏诱导的心肌适应在分子水平是通过激活PKC信号通路,降低炎症因子的表达,减少心肌细胞的凋亡,进而减少再灌注损伤；另外也通过调控Connexin43的表达减少心肌细胞的凋亡从而起到保护作用。第四部分摘要起搏诱导的心肌适应减轻大鼠急性心肌梗死后再灌注损伤长期效果的研究目的：探讨起搏诱导的心肌适应减轻大鼠急性心肌梗死后再灌注损伤的长期效果。方法：SD大鼠开胸结扎前降支30分钟后再灌注90分钟建立急性心梗再灌注损伤模型,右室心尖部旋入SelectSecure3830主动起搏电极。分成4组,分别为假起搏组：不予起搏；过程适应20(Per20)组：结扎10分钟后以基础自身心率加20次/分作为起搏频率,20个30秒起搏周期,每个间隔30秒起搏,之后松解再灌注；后适应20(Post20)组：结扎30分钟后松解结扎再灌注即刻,起搏20个周期；预适应20(Pre20)组：20个起搏后立即结扎前降支,30分钟后松解结扎再灌注。在开胸前和术后8周行经胸超声心动图,M型超声(M-mode)左侧胸骨旁长轴切面图像,测量左室舒张期前壁厚度(Leftventricularanteriorwall(diastole),LVAWd)、左室舒张期后壁厚度(Leftventricularposteriorwall(diastole),LVPWd)、左室舒张期内径(Leftventricularinternaldiameter(diastole),LVIDd)、左室射血分数(IVejectionfraction%,LVEF%)和左室缩短分数(LVFractionalShortening%,LVFS%)。8周后组织切片HE染色测定并计算质核比比值,Masson染色测量并计算心肌纤维化百分比；Western印迹法检测心肌组织PKC通路蛋白各亚型(pPKC、pPKC1、pPKC2和pPKC)、心肌细胞膜血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)的表达水平。结果：通过心脏超声检测,发现缺血再灌注损伤长期(8周)干预组心功能出现明显改善,LVEF%和FS%显著升高,LVAWd和LVPWd厚度增加较假起搏组明显好转,LVIDd扩张较假起搏组明显降低。反映心肌纤维化程度的Masson染色提示心肌适应干预组心肌纤维化百分比较假起搏组明显减少。HE染色发现,与假起搏组相比,干预组心肌细胞质核比比值明显降低。Western印迹法证实起搏诱导的适应使介导心肌肥厚的信号蛋白AT1R表达水平明显下调(P<0.01),其下游的PKC各亚型磷酸化活性形式(pPKC、pPKC1、pPKC2和pPKC)蛋白水平也下调(P<0.001),进而ERK活性形式pERK的表达水平也下调(P<0.001)。结论：起搏诱导的20起搏周期预适应、过程适应和后适应均能减轻SD大鼠急性心肌梗死后8周心肌纤维化,减少左室壁增厚、左室扩大和左室收缩功能的下降。起搏诱导的心肌适应在大鼠缺血再灌注损伤晚期通过下调AT1R表达水平,继而下调PKC信号通路蛋白表达活性,降低ERK活性形式的表达,从而降低心肌纤维化程度,一定程度抑制心肌重构,而达到改善心功能的作用。结论1.在新西兰兔和SD大鼠上建立急性前壁心梗和右室心尖部起搏在体模型是可靠；2.右室心尖部起搏诱导的预适应、过程适应和后适应能减轻缺血再灌注损伤；3.起搏诱导适应的分子水平机制为牵张作用下调PKC信号通路,降低炎症因子表达,减少心肌细胞凋亡,进而减少再灌注损伤；4.起搏诱导的预适应、过程适应和后适应能减少心梗后长期的心肌纤维化、左室扩大和左室收缩功能的下降；5.起搏诱导的适应对缺血再灌注损伤的保护作用是通过下调AT1R-PKC-ERK信信号通路,降低心肌纤维化,抑制心肌重构而改善左心收缩功能。创新点和研究意义1.首次发现右室心尖部起搏诱导的过程适应对缺血再灌注损伤保护作用的存在；2.首次在SD大鼠上建立了右室心尖部起搏的在体模型并证实起搏诱导的预适应、过程适应和后适应均能保护缺血再灌注损伤；3.发现起搏诱导的适应分子水平机制为牵张作用激活PKC信号通路,降低炎症因子的表达,减少心肌细胞的凋亡,进而减少再灌注损伤,为不同形式适应的机制提供了新的理论依据；4.更进一步观察到起搏诱导的适应不仅能减少即刻再灌注损伤,而且能减少心梗后长期心肌纤维化、左室扩大和左室收缩功能的下降,并发现这一作用可能通过AT1R-PKC-ERK信号通路来实现的。为PKC通路在细胞纤维化过程中的作用提供了佐证。5.本研究是对心梗后给予适应这一独特干预方式在形式和理论上的补充,而且起搏诱导在临床上具可操作性,在转化医学的背景下应用于临床实践,将可能进一步降低急性心梗的近期和远期死亡率,改变急性心梗的治疗模式。
【作者】邱朝晖；
【导师】葛均波；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】急性心肌梗死；再灌注；起搏；心脏收缩不同步；动物模型；心室收缩不同步；再灌注损伤；预适应；过程适应；后适应；凋亡；炎症因子；细胞凋亡；PKC；炎症因子转录基因；Connexin43；起搏诱导的适应；纤维化；左心收缩功能；长期；AT1R；ERK；

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