HIV-TAT PTD结构域介导的SOD_1转导对放射性皮肤损伤的治疗作用及机制研究

HIV-TAT PTD结构域介导的SOD_1转导对放射性皮肤损伤的治疗作用及机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2018-04-07 分类:参考文献 喜欢:3446
师大云端图书馆

【摘要】第一部分:TAT-SOD1原核表达载体的构建及重组蛋白的表达纯化目的:超氧化物歧化酶SOD由于具有催化超氧阴离子自由基降解为氧气和过氧化氢的功能,广泛应用于临床常用的皮肤射线防护喷剂中。但普通的SOD1蛋白一方面由于来源于动物血液,存在安全性隐患,另一方面由于分子量大,无法跨越细胞膜进入细胞内,限制了其应用。本研究拟在大肠杆菌中表达融合了蛋白转导结构域(PTD)HIV-TAT及人铜锌超氧化物歧化酶(Gu/ZnSOD,SOD1)的重组蛋白(TAT-SOD1),纯化上述蛋白后验证其蛋白转导作用及入胞后的生物学作用。方法:合成HIV-TAT结构域的编码序列(YGRKKRRQRRR)及利用聚合酶链反应(PCR)扩增人SOD1编码序列后,插入到原核表达载体pET-28a,由此产生了pET-28a-TAT-SOD1原核表达载体。我们同时构建了不含TAT结构域的pET-28a-SOD1原核表达载体。利用宿主大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白,超声破碎细胞后,利用镍-琼脂糖凝胶层析柱纯化后得到了重组TAT-SOD1蛋白。利用免疫荧光试验、SOD酶活试验,超氧阴离子清除试验及总抗氧化能力测定试验验证重组TAT-SOD1蛋白的跨膜作用及跨膜后的生物学活性。结果:成功构建了pET-28a-TAT-SOD1原核表达载体,导入大肠杆菌后,通过诱导表达纯化,得到了高纯度重组TAT-SOD1蛋白。免疫荧光结果显示重组蛋白能够跨细胞膜进入细胞。SOD酶活试验,超氧阴离子清除试验及总抗氧化能力测定试验结果示,入胞后的重组蛋白仍然保留生物学活性。结论:通过将原核表达载体pET-28a-TAT-SOD1导入大肠杆菌,表达及纯化得到重组TAT-SOD1蛋白,验证了其跨膜作用及跨膜后的生物学活性。第二部分:重组TAT-SOD1蛋白对皮肤细胞电离辐射损伤防护作用及机制研究目的:研究TAT-SOD1对比普通SOD1对人皮肤HaCaT细胞辐射损伤的防护作用及机制,进一步在动物模型上验证TAT-SOD1的辐射保护作用及其机制。方法:CCK-8实验检测细胞增殖能力的变化;AnnexinV-PI双染及WesternBlot检测凋亡相关蛋白用于检测电离辐射所致细胞凋亡;DCFH2-DA实验检测细胞内电离辐射诱导的自由基;Mito-Tracker线粒体染色实验检测电离辐射所致线粒体损伤;γH2AX免疫荧光检测DNA双链断裂(DSB)。建立放射性皮肤损伤的SD大鼠模型丙二醛(MDA)及DCFH2-DA用于检测SD大鼠电离辐射损伤后皮肤脂质过氧化及皮肤组织自由基水平。结果:在20GyX射线照射后,对比PBS组与普通SOD1组,TAT-SOD1组皮肤HaCaT细胞增殖能力损伤减轻。流式细胞仪分析TAT-SOD1组HaCaT细胞凋亡明显减少;WesternBlot表明凋亡相关蛋白Caspase-3,Bax表达明显减少、抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加,提示重组TAT-SOD1蛋白可以明显减轻电离辐射所致皮肤细胞HaCaT的凋亡。TAT-SOD1可以明显减轻X射线所致细胞内明显增加的自由基水平和线粒体损伤。5GyX射线照射后,TAT-SOD1组DNA双链断裂的数目明显减少,双链断裂的修复较PBS及普通SOD1组快。动物实验表明,45Gy电子线照射后,SD大鼠皮肤组织的脂质过氧化及自由基水平均明显升高,而TAT-SOD1可以明显抑制电离辐射所致脂质过氧化及活性氧水平。结论:TAT-SOD1能够明显减轻电离辐射所致HaCaT细胞损伤,并且能够减少SD大鼠电离辐射照射后皮肤组织的活性氧及脂质过氧化水平,为放射性皮肤损伤的救治提供了新的治疗策略。
【作者】谷庆;
【导师】曹建平;
【作者基本信息】苏州大学,放射医学,2014,硕士
【关键词】铜锌超氧化物歧化酶;蛋白转导结构域;HIV-TAT结构域;原核表达;电离辐射诱导皮肤损伤;细胞增殖能力;细胞凋亡;自由基;线粒体损伤;DNA双链断裂;脂质过氧化;

【参考文献】
[1]潘景才.四方公司热电联产战略研究[D].大连理工大学,2004.
[2]高艳霞.住房抵押贷款保险法律制度研究[D].中国政法大学,法律,2004,硕士.
[3]张宁.中药成分丁香酸、芥子酸和儿茶素的荧光性质及其分析方法研究[D].河北师范大学,化学生物学,2013,硕士.
[4]李明军,马保离.非完整移动机器人的连续时变鲁棒K指数镇定[J].控制与决策,2011,11:1706-1710.
[5]孟娜娜.0-3岁湿疹患儿睡眠状况的临床研究[D].大连医科大学,儿科学,2012,硕士.
[6]刘永欣,师峰,姜帅,席亚克,宋宁希,张仑山.智能变电站继电保护状态监测的一种模糊评估算法[J].电力系统保护与控制,2014,03:37-41.
[7]雒倞豪.宁夏中部同心县马铃薯膜下补灌灌溉制度试验研究[D].宁夏大学,水利工程(专业学位),2014,硕士.
[8]陶鼎来.十年实践的启示——纪念学会成立十周年谈对农业工程的认识[J].农业工程学报.1989(03)
[9]王尧.碳基纳米复合材料修饰电极及其性能研究[D].湖南大学,2013.
[10]黄警秋.岗位考核体系研究[D].重庆交通大学,项目管理,2012,硕士.
[11]邵国刚.分布式税务人事管理系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[12]吕立华,张健民,仇鸿平.基于逻辑稳定判据的遗传系数学习方法[J].冶金自动化,2003,05:1-4.
[13]汪志群.不同受区血运创面对静脉皮瓣成活面积影响的实验研究[D].河北医科大学,外科学(专业学位),2014,硕士.
[14]王力群.过渡金属(双)氢氧化物基电极材料制备及其超级电容器性能研究[D].兰州理工大学,材料加工工程,2014,硕士.
[15]吴琪.基于语料库海事英语对话中话语标记语的研究[D].大连海事大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[16]李杰青.中国农业银行F分行客户满意度研究[D].西南交通大学,工商管理(专业学位),2013,硕士.
[17]李振军.APCVD法生长ZnO单晶和薄膜[D].北京交通大学,2013.
[18]徐海巍,余世策,楼文娟.迎风墙面多开孔结构风致内压的试验研究[J].振动与冲击,2014,15:82-86+137.
[19]洪志刚.永嘉房地产公司改革与发展的研究[D].天津大学,技术经济及管理,2004,硕士.
[20]李林初.管理层收购与上市公司治理绩效研究[D].湖南大学,金融学,2003,硕士.
[21]李明望.投资者关系管理、股票流动性和资本成本[D].山东财经大学,会计学,2012,硕士.
[22]张旭宏.精神障碍者刑事责任能力相关问题研究[D].山东大学,法律(专业学位),2012,硕士.
[23]王璐.戊戌时期士大夫集团的农业观[D].吉林大学,中国近现代史,2013,硕士.
[24]易小龙.新型纳米二氧化硅类流体的制备及其复合材料[D].华南理工大学,2014.
[25]赵经纬.用微计算机实现的自寻最优点控制系统[J].自动化学报,1986,04:376-382.
[26]杜毅仁.触发器动态设计[J].自动化学报,1963,02:86-97.
[27]金小莉.汽车牌照自动定位算法研究[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[28]付家榕.在线组配技术在中筋类专用小麦粉生产的应用研究[D].南京财经大学,食品科学,2012,硕士.
[29]王石云.基于非平稳性信号分析的滚动轴承状态检测诊断研究[D].燕山大学,系统工程,2014,硕士.
[30]石闪闪.工程机械远程故障诊断中的数据处理技术研究[D].太原科技大学,电路与系统,2014,硕士.
[31]张宏伟.基于业务与财务双重视角的房地产企业成本控制研究[D].浙江工业大学,2013.
[32]乐志,朱道萸.自然是园林的主体——朱有玠大师园林设计思想和实践[J].中国园林.2004(01)
[33]刘洪涛.Si衬底表面湿化学法修饰研究[D].东北大学,材料物理与化学,2010,硕士.
[34]刘艳芳.发热伴血小板减少综合征患者急性期及恢复期细胞免疫功能的初步研究[D].华中科技大学,内科学,2013,硕士.
[35]余敏.消费者视角下旅游景区品牌延伸评价研究[D].山东大学,企业管理,2013,硕士.
[36]杨小丽.间充质干细胞对结肠癌靶向性及其生长影响的实验研究[D].福建医科大学,外科学,2014,硕士.
[37]何其梅.中学语文教学反思研究[D].扬州大学,学科教学,2011,硕士.
[38]齐济.面向中小型银行集中报表业务系统的设计与实现[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.
[39]余法建.水产品中恩诺沙星残留胶体金免疫层析检测技术的建立及应用[D].浙江海洋学院,渔业,2014,硕士.
[40]孙宇臣.感光材料影像形成过程的计算机模拟[D].河北大学,光学工程,2002,硕士.
[41]张桐鸣.六边形空间展开结构设计与分析[D].哈尔滨工程大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[42]王海霞.基于知识管理的高校图书馆学科服务研究[D].郑州大学,图书馆学,2013,硕士.
[43]马续莹.人教版翰林版McGraw-Hill版高中化学教科书栏目比较研究[D].首都师范大学,学科教学,2014,硕士.
[44]任丽闪.便携式在线变压器功率损耗测试仪的研究[D].湖北工业大学,电气工程(专业学位),2013,硕士.
[45]陈晓,王新民,黄誉,王晓燕.倾转旋翼机飞控系统的变精度粗糙集-OMELM故障诊断方法[J].控制与决策,2015,03:433-440.
[46]姜渌波.微博生产性受众解读[D].辽宁大学,新闻学,2012,硕士.
[47]周雪梅.复铁电性磁电子材料LCMTO的制备与性能研究[D].浙江大学,材料学,2004,硕士.
[48]陈剑.基于Web的扩张性信息选择方式[J].海南大学学报(自然科学版),2002,01:89-92.
[49]李洪明.跨铁路钢箱梁桥顶推法施工关键技术研究[D].西南交通大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[50]沈奕,滑峰,刘椿年.基于GDT的对FOIL系统的改进[J].北京工业大学学报,2005,02:204-209.

相关推荐
更多