骨保护素基因治疗抑制类风湿关节炎软骨破坏的实验研究
【摘要】前言类风湿关节炎(RheumatoidArthritis,RA)是一种病因未明,以反复发作的慢性小关节炎为主的疾病,其特征为关节滑膜增生以及关节软骨与软骨下骨的破坏。导致患者关节畸形、功能丧失以致生活能力下降的主要因素是软骨和骨的破坏。目前尚无有效抑制该进程的方法。在骨关节炎动物模型中观察到,骨保护素(Osteoproegein,OPG)可以有效抑制软骨和软骨下骨的破坏。在佐剂诱导关节炎动物模型(Adjuvant-inducedarthritis,AIA)中也发现,经OPG治疗的大鼠膝关节软骨组织得到近乎完全保护。但是有报道指出胶原诱导的关节炎(collagen-inducedarthritis,CIA)相对于AIA,其关节破坏更明显,更加接近于RA软骨的破坏。所以OPG对RA关节炎软骨的作用尚需进一步研究。而且,OPG抑制关节炎软骨破坏的病理机制尚未明了。软骨基质主要由纤维状的胶原蛋白网络和聚集的蛋白聚糖组成。软骨细胞是唯一的细胞成分,负责调节软骨的代谢。正常情况下,软骨细胞产生软骨基质。分泌多种因子,并在局部达到平衡,以调节软骨的新陈代谢和软骨基质的平衡。简言之,分解代谢因子,如基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)-1、3,9.13或解聚素和金属蛋白酶与血小板反应蛋白基序(adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondinmotifs,ADAMTS)-4,5可降解软骨的基质,而TIMP-1、2、3、4,IGF-I,TGF-β,BMP-2,bFGF等可以促进软骨基质合成,从而抑制MMPs等的作用,进而达到平衡,以保持软骨的自我更新。超负荷的压力或者炎症因子如IL-1,TNF-a等刺激可能打破软骨代谢的平衡,从而导致软骨基质降解和破坏。研究显示RA患者软骨破坏的主要原因是增生的滑膜和炎症细胞的侵蚀,但是至今并无能同时抑制滑膜炎症和软骨破坏的药物。从软骨破坏的内在机制,如软骨细胞凋亡和蛋白多糖丢失着手进一步探索,可能具有重大的临床意义。Kim等人发现,在RA患者关节软骨细胞较非RA患者软骨细胞的凋亡率显著增加。并且凋亡因子caspase3的表达在RA患者及动物模型的软骨中均明显增加。此外,通过番红O染色评估发现在CIA模型动物中蛋白聚糖丢失更为显著。表层的蛋白聚糖丢失通常是关节软骨破坏的第一步,在蛋白聚糖的降解中,ADAMTS-4,-5是主要的降解酶。本课题首次对OPG影响软骨细胞生长和功能进行系统的研究,体外细胞实验与动物体内实验相结合,在分子生物学,细胞学和病理组织学水平探索OPG对软骨细胞的影响,并初步探讨OPG抑制RA软骨破坏的机制：1)体外验证OPG对软骨细胞的增殖能力的影响；2)探索OPG影响软骨细胞的细胞内信号通路；3)探讨OPG对软骨细胞分泌细胞因子能力的影响；4)构建携带OPG基因的腺病毒,构建RA关节炎模型CIA；5)评价OPG基因治疗CIA大鼠后的关节软骨破坏；6)探讨软骨细胞凋亡在CIA软骨破坏中的作用以及OPG基因治疗对软骨细胞凋亡的影响；7)评价OPG基因治疗后ADAMTS-5的分泌水平的改变。第一部分骨保护素对体外软骨细胞增殖及分泌功能的影响目的体外研究骨保护素(osteoprotegerin,OPG)对软骨细胞增殖能力和分泌功能的影响。方法从1周龄SD大鼠的膝关节中,采用胶原酶消化法获取原代软骨细胞。甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞。本实验应用第一代软骨细胞。细胞计数试剂盒(CellCountingKit-8,CCK-8)检测5,10,20,25,50,100,200ng/ml浓度OPG对软骨细胞增殖能力的影响。以MEK抑制剂U0126,ERK抑制剂PD098059,P38MAPK抑制剂SB203580预处理30分钟,再加入OPG刺激,进行CCK-8试验,用以探索OPG对软骨细胞通路的影响。MAPK家族中的三条信号通路关键蛋白ERK,P38MAPK和JNK由蛋白质免疫印迹法(western-blotting)检测刺激后磷酸化水平。定量PCR和western-blotting测定OPG刺激后软骨细胞分泌的细胞因子和组成成分表达量的变化。结果OPG在5-50ng/ml浓度能促进软骨细胞增殖,最佳效应浓度为10ng/ml。U0126,PD098095可以显著抑制OPG诱导的软骨细胞增殖。OPG刺激后15分钟,软骨细胞内MEK和ERK蛋白的磷酸化分别增强至0分钟时的4.12倍和3.50倍,而P38MAPK和JNK的蛋白磷酸化则无明显变化。OPG显著下调软骨细胞ADAMTS-5分泌,上调TIMP-4的分泌,但对TIMP-1、2、3、IGF-I,TGF-p,bFGF,BMP-2,ADAMTS-4,Collegan-II,Aggrecan的表达无显著影响。同样,ERK蛋白抑制后,OPG诱导ADAMTS-5和TIMP-4的表达改变也被抵消。结论OPG通过MEK/ERK信号通路促进软骨细胞的增殖。同时,OPG能下调ADAMTS-5表达和上调TIMP-4的表达。第二部分腺病毒介导的骨保护素基因治疗对胶原诱导关节炎软骨破坏的抑制作用及其机制探讨目的研究腺病毒介导的OPG基因(adenovirus-mediatedOPG,Ad-OPG)治疗对胶原诱导的关节炎模型(collagen-inducedarthritis,CIA)大鼠软骨的保护作用,并探索可能的作用机制。方法取40只8周龄雄性SD大鼠诱导CIA模型。先以高速转头将牛胶原和弗氏不完全佐剂制备成乳化剂,然后以0.1ml乳剂尾根部皮下免疫SD大鼠。将CIA大鼠随机分成4组,早期治疗组(n=10)于关节炎出现后即注射30ulAd-OPG病毒(108pfu/ml),晚期治疗组(n=7)于关节炎出现注射等量Ad-OPG病毒,病毒对照组(n=13)注射Ad-GFP病毒,CIA对照组(n=7)注射PBS。正常对照组为无治疗的正常同龄大鼠。正常对照组为无治疗的正常同龄大鼠。在注射Ad-GFP病毒后2,7,14,21,28天分别处死1只大鼠,荧光显微镜观察GFP蛋白表达的量和分布。治疗后4周处死大鼠,取组织和血液样本,对组织进行染色后病理学评估,对血清样品进行ELISA检测软骨寡聚基质蛋白(COMP)和白介素-1(IL-1β)。结果成功诱导出37只CIA大鼠。荧光显微镜证实CIA大鼠关节中GFP的持续高表达。早期和晚期Ad-OPG注射均抑制蛋白聚糖丢失,但只有早期治疗才能同时降低软骨破坏评分和COMP的血清水平。TUNEL检测发现,早期和晚期AD-OPG治疗均显著抑制CIA大鼠软骨细胞凋亡,但只有早期AD-OPG治疗的caspase3的表达显著下降。ADAMTS-5阳性细胞的数量在早期和晚期Ad-hOPG治疗后均显著下降。Ad-OPG治疗不能显著改变CIA大鼠踝关节肿胀和IL-1p表达水平。结论早期Ad-OPG治疗显著抑制CIA大鼠的软骨破坏,其机制可能是通过抑制软骨细胞凋亡实现。此外,OPG可以通过抑制ADAMTS-5的表达而直接抑制CIA中软骨聚糖丢。
【作者】封志云；
【导师】陈中；
【作者基本信息】浙江大学，外科学，2014，硕士
【关键词】骨保护素；软骨细胞；增殖；MEK/ERK；ADAMTS-5；TIMP-4；OPG；软骨破坏；胶原诱导的关节炎；细胞凋亡；基因治疗；早期治疗；
【参考文献】
[1]张玮,满卫东,涂昕,林晓棋.衬底对CVD生长石墨烯的影响研究[J].真空与低温,2013,04:195-202+213.
[2]秦闻.后危机时代我国热钱流动的监管研究[D].复旦大学,金融学,2012,硕士.
[3]王思特.巴托克《小宇宙》探微[D].南京艺术学院,2004,硕士.
[4]肖灿俊.含有拓扑缺陷的石墨烯中电子输运性质的数值模拟研究[D].南京大学,2013.
[5]王宇雷.基于IEC61850的合并单元实用化研究[D].华中科技大学,电气工程,2013,硕士.
[6]张文英.高校体育专业健美操普修课“四阶段创新学法”的实验研究[D].湖南师范大学,体育教育训练学,2003,硕士.
[7]郭宏月.大肠杆菌核糖体RNA甲基化酶RlmM与RsmI的结构和功能研究[D].北京化工大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[8]温希祝,王中举.知识管理是完善现有网络教学系统的有效办法[J].贵阳金筑大学学报,2005,03:123-125.
[9]尹璐.多载荷对地观测卫星目标访问计算及任务调度方法的研究[D].国防科学技术大学,摄影测量与遥感,2012,硕士.
[10]代琳娜.微博污染传播模型的研究与应用[D].郑州大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[11]孙文茂.基于柔性三维度理论的制造企业生产方式实施效果研究[D].辽宁工程技术大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[12]于溟洋.论内蒙古少数民族作家汉语小说中的萨满文化[D].内蒙古大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[13]朱淑.基于初态学习的非线性控制系统的自适应迭代学习算法研究[D].北京交通大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[14]单张腾.吉林省高职院校生活指导课程开发[D].吉林农业大学,职业技术教育学,2012,硕士.
[15]黄海芳.基于改进BPSO算法的Web服务选择研究[D].湖南大学,计算机应用技术,2011,硕士.
[16]肖占山,朱世和,马静,王东,王志强,闵志强,桑九波.岩石电性参数频散特性对阿尔奇公式及Waxman-Smits模型的影响[J].石油地球物理勘探,2009,02:248-251+130+255.
[17]周冠斌.我国网络商行为制度研究[D].沈阳工业大学,民商法学,2012,硕士.
[18]孙枫.浅析灌木造林在三北工程建设中的地位与作用[J].林业经济.2003(08)
[19]熊富强,桂卫华,阳春华.针铁矿法沉铁过程铁离子浓度集成预测模型[J].控制与决策,2012,03:329-334+342.
[20]秦吉胜,王淑静,宋瀚涛.基于小波变换和反馈的时间序列相似模式搜索算法[J].北京理工大学学报,2004,12:1070-1073+1095.
[21]吴宝业.硫酸露点腐蚀用钢成分设计及耐蚀机理研究[D].华中科技大学,材料学,2013,硕士.
[22]张伦玠.轮式自动导航机器人的研制[D].广东工业大学,机械电子工程,2004,硕士.
[23]陈福杰.海信空调CMF设计研究与应用[D].山东大学,设计艺术学,2013,硕士.
[24]周长江.纳米流体热管内传热特性的数值模拟[D].江苏科技大学,轮机工程,2014,硕士.
[25]柴涛.基于嵌入式CAN总线锂电池管理系统的研究[D].哈尔滨理工大学,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[26]米传民,刘思峰,吴正朋,王建玲.基于反向累积法的强化缓冲算子序列的研究[J].控制与决策,2009,03:352-355+360.
[27]张政.我国行政奖励法律规制研究[D].华南理工大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[28]梁进伟.乌司他丁在CCl_4诱导的大鼠肝损伤中的保护作用研究[D].福建医科大学,麻醉学,2014,硕士.
[29]张燕楠.流行语的视觉转化与设计研究[D].首都师范大学,美术学,2014,硕士.
[30]田永超,朱艳,曹卫星.利用叶色特征监测小麦叶片的碳氮状况[J].植物生态学报,2005,03:357-360.
[31]高霞.咪唑类离子液体表面印迹聚合物的制备、性能及在环境样品前处理中的应用[D].河南师范大学,2014.
[32]赵春艳,高媛.解读EIS[J].现代情报,2002,12:153-154.
[33]高锐.黄连饮片中小檗碱的提取与重金属去除工艺的研究[D].安徽农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[34]张静静.民国时期中小学历史教科书的文化取向研究[D].信阳师范学院,历史教学论,2014,硕士.
[35]冯雅静.云南少数民族舞蹈在高校专业舞蹈教育中的传承研究[D].云南艺术学院,艺术学,2013,硕士.
[36]杜娜梅.政务微博在化解社会矛盾中的作用及实现[D].河北经贸大学,新闻学,2014,硕士.
[37]尹艳佳.改写理论视角下的艾青诗歌英译研究[D].湖南师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[38]张小蒂,曾可昕.中国电子商务发展的可持续性——以企业家才能内生提升为视角[J].学术月刊,2014,10:66-74.
[39]张燕.我国上市公司退市制度的完善[D].西南交通大学,经济法学,2014,硕士.
[40]唐亮贵.基于多Agent的电子商务市场结构及交易模型研究[D].重庆大学,2009.
[41]唐群.中长跑教学对中学生逆商培养的影响分析[D].湖南师范大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[42]朱璐瑶.二氧化氯杀灭拟柱孢藻过程中藻毒素的释放与降解研究[D].广东工业大学,市政工程,2014,硕士.
[43]刘叶,邹晓东.探寻创业型大学的“中国特色与演变路径”——基于国内三所研究型大学学术创业实践的考察[J].高等工程教育研究,2014,03:44-49.
[44]李枫.经典建构之路—《在路上》在中国的译介研究[D].安徽大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[45]陈宇.脂肪来源干细胞移植对大鼠心肌梗死后心脏功能的影响[D].遵义医学院,心血管内科（专业型学位）,2012,硕士.
[46]魏衍亮.知识产权战略促进企业跨越发展模式分析[J].科技成果纵横,2005,01:28-30.
[47]赵瑾.东周时期出土玉璧用途的初步研究[D].中国艺术研究院,美术学,2013,硕士.
[48]王亚花.吉林省新型农村养老保险制度研究[D].中南林业科技大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[49]唐豪杰.Werner衍生态及WLQCC态中量子关联的研究[D].安徽大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[50]李洁民.桂林山水画史料及发展脉络研究[D].广西师范大学,美术学,2013,硕士.
