建立筛选尼克酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂的方法

【摘要】目的：建立筛选尼克酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制剂的方法。方法：以1,4-二马来酰亚胺基丁烷(1,4-Bismaleimidobutane,BMB)交联G355C/D393C双突变NAMPT,封堵其催化活性中心,以NAMPT野生型及交联型NAMPT蛋白的自发荧光变化(280nm激发,333nm发射),来检测化合物与蛋白的结合,以核磁共振方法体外检测化合物对NAMPT催化作用的影响,以MTT方法检测化合物对细胞活性的影响。结果：FK8660.1-1.0μM能够浓度依赖的抑制野生型NAMPT自发荧光,但对BMB-NAMPT的自发荧光没有影响。迷迭香酸、洋蓟素、1,3二咖啡奎宁酸0.5-50μM能够浓度依赖的抑制野生型NAMPT和BMB-NAMPT的自发荧光,对两种蛋白自发荧光的抑制率无显著差异。FK866分子比1:1(化合物:NAMPT蛋白)能够显著抑制NAMPT的催化作用,但迷迭香酸、洋蓟素、1,3二咖啡奎宁酸分子比100:1(化合物:NAMPT蛋白)对NAMPT的催化作用无抑制作用。10-7MFK866时间依赖的抑制A549细胞的活性,10-8～10-5M迷迭香酸、洋蓟素、1,3二咖啡奎宁酸对A549的细胞活性无抑制作用,反而在高浓度下对A549细胞的细胞活性有一定的增强作用。结论：基于NAMPT和BMB-NAMPT蛋白的内源性荧光检测法可以筛选与NAMPT蛋白结合的化合物,并分析化合物是否结合在NAMPT的催化活性部位,迷迭香酸、洋蓟素、1,3二咖啡奎宁酸可结合在NAMPT催化活性位点以外的部位。目的：建立一种筛选尼克酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)非酶作用阻断剂的细胞模型。方法：通过突变,获得酶活作用完全消失的NAMPT蛋白,以荧光光谱法检测无ATP时NAMPT的催化作用；以Realtime-PCR方法检测IL-6mRNA的表达,观察各种NAMPT蛋白诱导BV2细胞和THP-1细胞IL-6mRNA表达的作用；获得稳定转染pIL-6-promoter-luc质粒的BV2细胞株,用于IL-6mRNA表达的高通量筛选。结果：H247A、R311D、R392E、K423E突变均能够显著减弱JAMPT蛋白的催化作用,其中R392E突变使NAMPT的催化作用完全消失。NAMPT蛋白能够诱导BV2细胞和THP-1细胞表达IL-6mRNA,其作用与催化作用的强度呈负相关。基于IL-6报告基因的细胞模型可以用于NAMPT非酶作用的检测。结论：R392E突变的NAMPT蛋白攻击BV2细胞或THP-1细胞,检测IL-6mRNA的表达水平,可以用于筛选NAMPT非酶作用阻断剂,而稳定表达IL-6报告基因的BV2细胞可以作为高通量筛选的细胞模型。
【作者】韩雪；
【导师】张纬萍；
【作者基本信息】浙江大学，药理学，2014，硕士
【关键词】NAMPT抑制剂；FK866；内源荧光光谱法；BMB-NAMPT；NAMPT；非酶作用阻断剂；Realtime-PCR；IL-6mRNA；

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