α1-抗胰蛋白酶对白蛋白—胰岛素结合抑制作用及其机制

【摘要】糖尿病是一种以血糖代谢紊乱为特点的常见慢性疾病,其中90%以上为2型糖尿病(type2diabetes,T2DM)。近年来研究发现胰岛素抵抗在2型糖尿病发病中起重要作用,并贯穿于2型糖尿病全过程。关于胰岛素抵抗的发生机制尚不完全清楚,各种实验研究结果显示,胰岛素抵抗的发生多是与炎症反应、激素因子作用、内质网应激以及过量的营养产物在胰岛素敏感组织堆积等共同作用有关。妊娠期糖尿病(gestationaldiabetesmellitus,GDM)是指在妊娠期首次发生或发现的不同程度的糖代谢异常。GDM发病机制至今尚不清楚,它由多种因素作用所致,胰岛素抵抗和胰岛p细胞分泌降低是GDM发病机制的重要环节。白蛋白是最主要的血浆蛋白之一,在大量内源性和外源性物质的结合和转运方面发挥重要的作用。白蛋白具有胰岛素样或是抑制胰岛素样活性,而且血清中的胰岛素大多与血清蛋白相结合。我们之前的研究结果表明：首先,在血清中存在两种不同形式的胰岛素即游离胰岛素和结合胰岛素。游离胰岛素作为活性形式而结合胰岛素作为非活性形式存在；其次,血清白蛋白作为胰岛素的转运体和存储体；最后,白蛋白和胰岛素的结合与解离可以调节血糖水平和细胞功能。根据以上三点,我们提出胰岛素抵抗发生机制的新设想：我们假设游离胰岛素是作为可供机体立即利用的活性形式,结合胰岛素则处于非活性状态,但可从结合蛋白质中分离从而保持游离胰岛素水平的稳定。在某些病理状态下,例如高脂血症和肥胖时,这种平衡可以发生改变。如果血清白蛋白-胰岛素结合力增加,则可供利用的游离胰岛素水平降低；相反,如果血清白蛋白-胰岛素结合力降低,由于游离胰岛素半衰期很短,则可供利用的游离胰岛素水平在餐后上升而在空腹水平时下降。不论是在哪种条件下,胰腺都要分泌更多的胰岛素以维持血糖在空腹和餐后状态下的正常水平。如果这种补偿机制失衡,则正常的空腹血糖水平无法维持。因此,在我们接下来的研究中,将会着重探索影响白蛋白-胰岛素结合力的未知的病理因素及其是如何发挥作用的,从而为我们所提出的胰岛素抵抗的新设想以至糖尿病的发生机制提供进一步的理论依据。我们的实验主要分为两部分：第Ⅰ部分：2型糖尿病与妊娠期糖尿病的蛋白质组学研究。我们采用2型糖尿病病人和妊娠期糖尿病病人分别与其对照者的血清进行蛋白质组学研究,筛选出这两组病人与其对照在血清蛋白表达上的共同点,发现可能影响白蛋白-胰岛素结合力的重要因子。12例2型糖尿病病人和10例匹配对照者的血清以及9例妊娠期糖尿病病人和8例匹配对照者的血清用来进行双向电泳,随后用软件对图谱进行分析和匹配,并对在两组中发生相同显著差异变化的4种蛋白质进行质谱鉴定。结果显示：2型糖尿病病人和对照者血清蛋白质双向电泳图谱进行图像分析和匹配后发现,两种图谱的蛋白点数分别为465±11和423±15,其中共有269个蛋白点相互匹配,匹配率平均为61%。在这些匹配的蛋白点中,共有19个蛋白点发生显著性差异变化(以3倍变化幅度为基准),其中在2型糖尿病中表达上调的蛋白点有8个,表达下调的蛋白点有11个。对妊娠期糖尿病病人和其对照者血清蛋白质双向电泳图谱进行分析和匹配后发现,两种图谱的蛋白点数分别为325±18和342±10,其中共有197个蛋白点相互匹配,匹配率平均为59%。在这些匹配的蛋白点中,共有30个蛋白点发生显著性差异变化(以3倍变化幅度为基准),其中在妊娠期糖尿病中表达上调的蛋白点有19个,表达下调的蛋白点有11个。综合分析上述发生变化的蛋白点,我们发现有2个蛋白点在2型糖尿病和妊娠期糖尿病病人血清中均表达上调,同时也有2个蛋白点在这两组病人血清中均表达下调。对这4种蛋白点的质谱鉴定结果显示它们分别为α1抗胰蛋白酶、血管紧张素原、凝集素和人血白蛋白与十四酸和三碘苯甲酸的复合物。其中α1抗胰蛋白酶和血管紧张素原在两组糖尿病中表达下降,与对照组的相对表达量分别是-3.82±0.73和-4.76±0.33；而凝集素和人血白蛋白与十四酸和三碘苯甲酸的复合物在两组糖尿病中表达上升,与对照组的相对表达量分别是15.6±2.49和3.13±0.23。第Ⅱ部分：α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素结合力的影响。在第Ⅰ部分的实验中,我们研究发现了在两组糖尿病病人中发生改变的4种蛋白质,其中a1抗胰蛋白酶在血清中的数量级最高,与白蛋白的分子数最为匹配,预计对白蛋白的结合或解离状态影响最大,因此,我们选择α1抗胰蛋白酶作为研究对象,观察其在影响白蛋白-胰岛素结合力方面所发挥的作用。首先,我们用免疫共沉淀的方法去证明血清中白蛋白和α1抗胰蛋白酶的结合。用α1抗胰蛋白酶的抗体去沉淀与之结合的蛋白,非特异IgG作为对照。结果显示在α1抗胰蛋白酶抗体组可明显检测到α1抗胰蛋白酶,同时也可以检测到大量白蛋白；在非特异IgG组则未发现有α1抗胰蛋白酶。然后,我们用体外实验证明不同浓度α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素结合力的影响。结果显示：与正常浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组相比,低浓度a1抗胰蛋白酶明显增加了结合胰岛素/游离胰岛素的比值(2.41±0.17vs1.76土0.20,P=0.0024)；低浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组和高浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组之间该比值更加明显(2.41士0.17vs1.53士0.18,P=0.0004)；而正常浓度al抗胰蛋白酶/白蛋白组和高浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组之间该比值没有统计学意义(P=0.1406)。接下来,我们观察了白蛋白和胰岛素对小鼠血清α1抗胰蛋白酶浓度的影响。结果发现在α1抗胰蛋白酶/白蛋白低于正常时,注射白蛋白可提高血清α1抗胰蛋白酶浓度,而α1抗胰蛋白酶/白蛋白正常或者高于正常时,白蛋白对α1抗胰蛋白酶浓度无影响。相反,注射胰岛素可显著降低注射PBS或者少量(0.64mg/ml)α1抗胰蛋白酶小鼠的血清α1抗胰蛋白酶浓度。由于免疫共沉淀结果显示血清中胰岛素与α1抗胰蛋白酶不结合,这就提示胰岛素与α1抗胰蛋白酶竞争结合白蛋白。我们进一步观察白蛋白/α1抗胰蛋白酶比值对血糖浓度的影响,结果显示：低α1抗胰蛋白酶(0.64mg/ml)/白蛋白比值组中小鼠的血糖水平明显升高,阻止了胰岛素诱导的低血糖反应。将注射液的αl抗胰蛋白酶的浓度增加到2.58mg/ml和10.30mg/ml后,胰岛素诱导的低血糖反应则出现加大且延长。α1抗胰蛋白酶的浓度与血糖水平的变化呈现出负相关关系。注射不含白蛋白的α1抗胰蛋白酶溶液则与注射正常和高α1抗胰蛋白酶/白蛋白比值组类似。因此,我们认为α1抗胰蛋白酶通过抑制白蛋白和胰岛素的结合来发挥降血糖的作用。我们首次发现α1抗胰蛋白酶可通过与胰岛素竞争结合白蛋白,促使胰岛素从胰岛素-白蛋白复合物中解离和利用,从而调节血糖水平。低α1抗胰蛋白酶血症可能是2型糖尿病和妊娠期糖尿病胰岛素抵抗的重要机制,为糖尿病的发生和发展提供了新的机制,具有临床潜在应用价值。昼夜节律生物钟(circadianclock)参与调控机体行为与各项生理功能。昼夜节律的产生依赖于各种生物钟基因(clockgene)的转录-翻译反馈环路。钟基因可以通过调节下游的钟控基因(CCGs)调节多项生理功能。研究表明,昼夜节律生物钟不仅参与生理功能的调节,在多种病理过程中如心血管系统疾病、肿瘤中也发挥了重要的作用。急性心肌梗塞(AcuteMyocardialInfarction,AMI)是动脉粥样硬化的终末病变,其发病具有明确的昼夜节律,在早晨高发。目前对这种现象发生的机制还未研究清楚,但可能与昼夜节律生物钟有关。本研究将利用apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠建立动脉粥样硬化模型,以研究动脉粥样硬化发病过程中动脉粥样硬化相关基因：纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(Pai-1)、组织因子(TF)、内皮素-1(ET-1)和基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2及MMP-9)的昼夜节律表达变化,为研究动脉粥样硬化的发病机制提供新的理论依据。apoE-/-小鼠心脏动脉粥样硬化相关基因表达节律的改变。利用apoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化早期及进展期动物模型。使用3月龄apoE-/-小鼠48只,分为两组,每组24只,一组给予普通膳食,一组西方类型膳,以24只同龄雄性C57BL/6J作为对照,在12光照/12黑暗(12L/12D)环境中饲养4周。根据ZeitgaberTime,分别在ZTO、ZT4、ZT8、ZT10、ZT12、ZT14、ZT16、ZT20八个时间点处死小鼠；取小鼠主动脉起始段做冰冻切片,油红O染色检测动脉粥样斑块；取小鼠心脏液氮速冻,-70℃冰箱保存。利用Real-timeRCR检测apoE-/-与C57BL/6J小鼠心脏动脉粥样硬化相关基因t-PA、Pai-1、TF、ET-1和MMP-1、MMP-2及MMP-9在不同时间点的表达变化。结果显示给予了普通膳食的apoE-/-小鼠尚未形成明显的粥样斑块,但其主动脉内皮下已经形成泡沫细胞；给予西方类型膳的apoE-/-小鼠主动脉有明显的动脉粥样硬化斑块出现,油红O染色显示粥样斑块内存在明显的脂质沉积。因此,给予普通膳食与西方类型膳的apoE-/-小鼠分别处于动脉粥样硬化的早期与进展期。Real-timePCR结果显示C57BL/6J小鼠心脏中Pai-1,t-PA,TF和ET-1的表达高峰出现在ZT14和ZT16之间,表达低谷出现在ZT10；在给予普通膳食的apoE-/-小鼠中三者表达失去了节律；而在给予西方类型膳的apoE-/-小鼠中表达高峰在ZT4,表明三者表达节律出现完全相反的变化。在C57BL/6J小鼠和apoE-/-小鼠心脏中MMP-1、MMP-2及MMP-9三种基因的表达均未出现明显的节律变化。综上所述,我们首次发现apoE-/-小鼠发生动脉粥样硬化的过程中,心脏动脉粥样硬化相关基因中某些基因在表达水平与节律发生了改变。这些改变可能在动脉粥样硬化的病理过程中发挥了重要的作用,对其具体作用以及发生机制仍在进一步研究中。
【作者】张雪晴；
【导师】陈思锋；
【作者基本信息】复旦大学，病理学与病理生理学，2010，博士
【关键词】α1抗胰蛋白酶；糖尿病；胰岛素抵抗；白蛋白；胰岛素；昼夜节律生物钟；动脉粥样硬化；血栓形成；急性心肌梗塞；apoE基因敲除小鼠；

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