蜡梅[Chimonanthus praecox (L.) Link]CpAGL2基因的克隆及功能初步分析

【摘要】蜡梅[Chimonanthuspraecox(L.)Link]属蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(ChimonanthusLindl.)多年生木本植物,其花瓣亮黄,集色、香、形、姿于一体,是一种冬季观花灌木,作为冬季鲜切花和园林观赏植物大量应用在人们的生活当中。目前,关于蜡梅开花过程中生理生化变化的研究有较多报道,但关于蜡梅开花调控的分子机理研究还较为匮乏。MADS-box基因家族是一类调控花器官发育的基因,名称来自MCM1(酿酒酵母)、AGAMOUS(拟南芥)、DEFICIENS(金鱼草)和SRF(人血清应答因子)的首写字母。大多数MADS-box基因在植物生殖发育过程中起重要作用,同时也参与调节营养生长、子房发育、根的形成等。本研究从己构建好的蜡梅花(品种：罄口蜡梅)cDNA文库中成功克隆得到一个AGL2的同源基因序列,命名为CpAGL2。通过对该基因进行生物信息学分析、不同组织和花发育不同时期的基因表达分析以及在拟南芥中超表达分析,初步验证该基因的功能。主要的研究结果如下：1CpAGL2基因的生物信息学分析通过随机克隆测序的方法获得蜡梅CpAGL2基因的cDNA序列,该基因含有712bp的最大ORF框,编码237个氨基酸残基。BLAST分析表明该基因与其他植物AGL2基因序列有较高的同源性。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的二级结构主要由45.57%的α-螺旋、41.35%的无规则卷曲以及13.08%的延伸链组成；该蛋白存在10个丝氨酸磷酸化位点和3个苏氨酸磷酸化位点,无信号肽。亚细胞定位结果分析表明该基因可能在细胞核内表达。2CpAGL2基因的转录水平分析利用实时荧光定量PCR进行基因表达分析,结果表明：CpAGL2基因在蜡梅根、茎和叶中几乎不表达,而在花器官中优势表达,其中在雌蕊中的相对表达量最高,其次是外瓣,在中瓣、内瓣和雄蕊组织中相对表达量接近。在蜡梅花发育的早期(萌动期),CpAGL2基因几乎不表达,随着蜡梅花器官的进一步发育,CpAGL2表达水平呈上升趋势,直至露瓣期,花的四轮器官初步形成,花部结构完善,表达量趋于稳定。伴随着花器官进入衰败期,该基因相对表达量增高并达到整个花期的峰值。推测该基因可能不参与花器官的早期分化,但与花器官的衰老相关。3CpAGL2基因在拟南芥中的过表达分析成功构建了植物过表达载体pCAMBIA2301g-cpAGL2,并转入农杆菌GV3101。应用花序侵染法转化拟南芥,对侵染后的拟南芥种子进行卡那霉素(Kanamycin)抗性筛选,直至筛选到T2代。对T2代转基因植株进行GUS染色和半定量分析表明共得到6个T2代转基因拟南芥单株系。对转基因拟南芥进行表型观察发现,转基因植株和野生型植株没有明显的表型变化,花期也没有明显差异。但是在表达量最强的两个株系中,出现雄蕊数目减少的现象,推测CpAGL2基因可能参与了雄蕊的发育。
【作者】罗登攀；
【导师】李先源；眭顺照；李名扬；
【作者基本信息】西南大学，园艺学，2014，硕士
【关键词】蜡梅；CpAGL2基因；基因表达分析；转基因拟南芥；

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