类泛素分子Urm1修饰相关蛋白及大肠杆菌ExoI蛋白的结构与功能研究

类泛素分子Urm1修饰相关蛋白及大肠杆菌ExoI蛋白的结构与功能研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-12-27 分类:期刊论文 喜欢:3299
师大云端图书馆

【摘要】泛素分子(UB)和类泛素分子(UBLs)是一些小分子量蛋白,通过共价连接到蛋白质底物上,涉及一系列重要的胞内生理进程。真核生物中的Urm1是最古老的类泛素分子,在酵母中起到很多非常重要的作用,如抗氧化能力,对环境的耐受性和繁殖出芽等等。Urm1修饰系统在胞内涉及转硫作用(tRNA修饰)和蛋白类泛素修饰两方面,被认为是进化过程中的分子化石,是连接原核的转硫系统和真核的泛素家族的进化分支点。Urml系统中的Tuml蛋白是其中的重要组分,负责绝大部分的Nfs1至Uba4的转硫作用。本研究成功建立了酵母Urm1系统相关蛋白的原核表达纯化系统,并采用气相悬滴扩散法在20℃条件下培养出Tuml蛋白晶体,收集和分析了该晶体的X-射线衍射数据,衍射分辨率为1.9A。Tum1晶体的空间群属于141晶系,其晶胞参数为a=b=120.94A,c=48.35A,α=β=γ=90°。以人类3-巯基丙酮酸硫基转移酶(PDBID:30LH)的晶体结构为模型,采用分子置换法解析出Tumml的晶体结构。酵母Tumml晶体结构总体呈椭球状,拥有11个α螺旋和7个β折叠,大体上等分成两块,分属两个RLD结构域(rhodanese-likedomain).两块之间形成一个沟型地带,活性位点Cys259残基处于沟底。通过对Tuml晶体结构的分析,发现其活性位点Cys259被过硫化修饰,且活性位点附近有未知的配体小分子存在。通过实验排除了配体小分子为羟脯氨酸的可能性。大肠杆菌外切核酸酶1(Exol)是一种只从单链DNA的3’端往5’端进行持续水解的外切脱氧核糖核酸酶。Exol参与多种染色体的损伤修复和重组过程,如DNA上脱嘌呤和脱嘧啶位点的修复,氧化伤害导致的3’端磷酸羟乙酸基的去除,甲基指向的DNA链错配修复,以及抑制移码突变等等。本研究成功克隆纯化了大肠杆菌E×ol蛋白,并采用气相悬滴扩散法和气相坐滴扩散法在20℃条件下培养出Exol和3’端磷酸化修饰的单链DNA(12A-3’PHO)共结晶,Exol和dTTP共结晶以及活性抑制态Exol等若干结晶。成功收集了活性抑制态Exol结晶的X-射线衍射数据,衍射分辨率2.5A。此Exol晶体的空间群属于P212121晶系,其晶胞参数为a=67.25A,b=126.64A,c=141.25A,α==β=γ=90°。以已有的Exol晶体结构(PDBID:1F××,2QXF,3C94,3C95,3HL8,3HP9)为模型,采用分子置换法解析出活性抑制态E×ol晶体结构,发现该晶体结构中不含Mg2+离子,每个不对称单位中含有两个Exol蛋白分子。通过体外活性实验确定Mg2+离子缺失对Exol活性的完全抑制作用,和单链DNA3’端磷酸化修饰对Exol活性的不完全抑制作用,并且发现DNA的3’端自由羟基并非Exol活性所必须。在以上实验结果的基础上,提出Exol活性抑制的位阻效应假说。本论文主要对Tum1和Exol的晶体结构和生物学功能进行了研究。通过晶体X衍射法,我们首次得到并解析了Tum1和活性抑制态Exol的晶体结构。通过晶体结构分析和体外实验结合的方法,揭示它们可能的作用机制。
【作者】邱瑞;
【导师】谢毅;
【作者基本信息】复旦大学,遗传学,2011,博士
【关键词】类泛素;Urm1;Tum1;核酸酶;Exol;晶体结构;酶学活性;

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