硫化氢促血管新生机制研究

【摘要】硫化氢(HydrogenSulfide,H2S)是一种有臭鸡蛋味的无色气体,大量吸入可致中毒,过去一直被认为是毒性气体。但是,从上世纪90年代开始,人们对硫化氢这种气体物质有了新的认识。1989年,科学家在大鼠和人脑中检测到了内源性的H2S,提示H2S可能具有一定的生理作用。近年来不断有研究发现多种哺乳动物细胞自身能产生H2S,在正常大鼠的血液中H2S浓度达到46μmol/L,在脑中H2S浓度高达100μml/L。内源性H2S主要由胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase,CSE)或胱硫醚-p-合酶(Cystathionineβ-synthase,CBS)分解L-半胱氨酸产生。CSE主要存在于心血管系统中,CBS主要存在于神经系统中。内源性H2S对神经系统、心血管系统、消化系统和呼吸系统均有重要的生理调节功能。另外,H2S是一种小分子量的气体分子,能穿透细胞膜直接起效,在体内产生且受内源性关键酶的调控。因此,近些年来,人们对H2S不断加以重视,将其定位于包括一氧化氮、一氧化碳在内的气体信号分子家族,是第三个气体信号分子。在心血管系统,H2S通过兴奋KATP通道,增加KATP通道电流,使细胞膜出现超极化而使血管平滑肌舒张,降低血压；H2S可抑制平滑肌细胞异常增殖,并促进其凋亡,缓解血管结构重构；另外,H2S对心脏有负性肌力作用,并能减轻缺血再灌注引起的心肌损伤。本课题组于2007年首次研究发现,H2S能够促进血管新生,该结果不仅在恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞株RF/6A上,而且在C57小鼠Matrigelplug模型上得到证实。2009年本课题组在大鼠单侧后肢缺血模型中,又进一步证实,H2S能够促进大鼠缺血下肢的血管新生。另外,H2S的促血管新生的效应在鸡胚绒毛膜尿囊CAM模型中得到证实。血管新生是指在原有血管基础上长出新的毛细血管,其过程包括血管外基质降解,内皮细胞增殖、迁移形成子代血管支。这一现象可发生于胚胎发育、组织器官生长、创伤修复、肿瘤的发生与转移、糖尿病等多种生理、病理过程中。在血管新生过程中,多种生长因子起到促进／抑制调控作用,其中,血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)作为促进因子,其激活血管内皮细胞生长因子受体-2(VascularEndothelialGrowthFactorReceptor-2,VEGFR-2)产生的级联反应是血管新生过程中最核心的信号通路,能够促进血管内皮细胞的存活、增殖和迁移。血管新生与血管内皮细胞的增殖和迁移有密切关联,其中,血管内皮细胞的迁移过程在血管新生中起着重要的作用。本课题组前期研究结果显示,H2S在人脐静脉内皮细胞细胞有促进体外血管新生的作用。NaSH仅在低浓度(10μmol/L)能够促进细胞增殖；而NaSH在30-200μmol/L都能显著促进细胞迁移和体外管腔形成。并且,H2S促进血管新生的作用不依赖于VEGF的表达变化,但是依赖于VEGFR-2/PI3K/Akt信号通路。另外,H2S与重组蛋白VEGFR-2的直接反应结果显示H2S可以直接提高VEGFR-2的活性,但对PI3K/Akt的活性没有影响。这就提示,H2S在血管内皮细胞中的靶分子是VEGFR-2。因此,本课题以VEGFR-2为研究对象,主要针对H2S激活VEGFR-2的具体机制进行研究,以阐明H2S促进血管新生的具体机制。首先,我们进一步研究了H2S对VEGFR-2的作用。VEGFR-2中含有多个酪氨酸磷酸化位点：Tyr951、Tyr996、Tyr1054、Tyr1059、Tyr1175以及Tyr1214。实验结果显示,VEGF(lOng/ml)可以显著提高所有磷酸化位点的磷酸化水平,而NaSH(50μmol/L)仅对Tyr1175位点的磷酸化水平有提高作用,这提示,H2S对VEGFR-2的激活很可能不同于其经典激活剂VEGF的激活方式。用siRNA将VEGFR-2的基因沉默以后,WesternBlot检测结果显示,VEGFR-2蛋白表达水平降低,说明基因沉默体系建立成功；而且与转染了阴性对照的细胞相比,H2S在转染VEGFR-2siRNA的内皮细胞上的促细胞迁移作用下降。这进一步说明,VEGFR-2在H2S促进内皮细胞迁移过程中起着至关重要的作用。另外,我们分别比加入H2S提前0.5小时和24小时向细胞培养基中添加VEGF的中和抗体anti-VEGF,观察到提前0.5小时加入anti-VEGF不能阻断H2S的促进细胞迁移作用；而提前24小时加入anti-VEGF却能阻断H2S的促进细胞迁移作用。这个结果提示,H2S激活VEGFR-2进而促进血管新生的作用需要基础水平VEGF的作用。其次,我们对VEGFR-2重组蛋白进行酶解之后的质谱检测分析,结果显示,VEGFR-2中Cys1045与Cys1024之间存在一个二硫键,当NaSH处理之后,这个二硫键被打断,而且没有发现任何其他形式的修饰。之后我们合成了VEGFR-2中主要功能片段的多肽,以及用二硫键连接的Cys1045-Cys1024模拟六肽,用NaSH与功能肽段、模拟六肽、20种基本氨基酸和胱氨酸进行直接反应后用ESI-MS进行质谱检测分析,分析结果显示,NaSH对功能肽段和20种基本氨基酸都没有任何修饰作用,但是可以打断模拟六肽和胱氨酸中的二硫键。这些结果证实,NaSH对VEGFR-2的直接作用很可能仅仅是打断了该受体中的二硫键,而没有产生任何其他的修饰作用。为了进一步证实VEGFR-2中Cys1045与Cys1024之间的二硫键是NaSH作用的靶点,我们将Cys1045位突变为丙氨酸(Ala),阻止Cys1045与Cys1024之间形成二硫键。突变之后的VEGFR-2其激酶活性提高,而且H2S不能再直接激活突变体VEGFR-2(C1045A)。为进一步验证VEGFR-2中Cys1045与Cys1024之间的二硫键是H2S促内皮细胞迁移的作用靶点,我们用慢病毒载体将突变的VEGFR-2(C1045A)转染入HUVECs并使其表达。在划痕损伤实验中,与转染了对照空质粒的细胞相比,转染VEGFR-2(C1045A)的HUVECs,其细胞迁移作用明显增强。虽然在转染了对照质粒的细胞中,H2S仍有促迁移作用,但转染了突变VEGFR-2(C1045A)的细胞,H2S的促迁移作用被取消。这些数据不仅表明,Cys1045-Cys1024二硫键作为一种抑制序列发挥作用,也证明作为VEGFR-2介导的H2S促进内皮细胞迁移的靶结构,Cys1045-Cys1024二硫键发挥着复杂作用。另外,我们还测定了迁移与未迁移的血管内皮细胞中的活性氧(ROS)水平。定量分析表明,与未迁移的细胞相比,迁移的细胞内ROS水平明显增加,这表明在细胞迁移过程中可能会出现一个短暂的细胞内氧化环境；而免疫荧光双标染色显示,在迁移过程中的细胞,ROS与VEGFR-2共定位,这进一步表明在细胞迁移过程中,VEGFR-2处于一个短暂的细胞内氧化环境。然后,我们探讨了H2S打断二硫键的作用机制,并对H2S发挥作用的主要形式作初步的探索。用与NaSH相同氧化还原能力的维生素C处理胱氨酸,ESI-MS检测分析显示,维生素C不能打断胱氨酸的二硫键,这提示,NaSH打断二硫键的作用不完全是因为其还原能力。H2S在水溶液中通常以H2S气体和HS-离子两种形式存在。pH值越高,HS-离子形式越多；pH值越低,H2S气体形式越多。我们在不同pH条件下进行NaSH与胱氨酸或者模拟六肽的直接反应。结果显示,当反应体系pH<5.5时,NaSH将不再能够打开胱氨酸或者六肽之间的二硫键。这提示,很可能是HS-在发挥打断二硫键的作用。在研究H2S和胱氨酸直接反应的过程中,我们还找到了中间产物Cys-SSH,推测H2S打断二硫键的过程是一个以HS-作为亲核集团攻击二硫键的两步反应。而且这个推测也用量子化学计算得到证实,这对我们深入了解H2S打断二硫键的具体机制提供了实验依据。最后,检测产生内源性H2S的酶CSE和CBS在HUVECs上的表达与分布。免疫荧光染色结果显示,HUVECs不仅有CSE表达,而且同时有CBS表达。CSE主要分布在靠近细胞膜的细胞内区域,CBS则主要分布于胞浆。而且,免疫荧光双标染色显示,在HUVECs,CSE和CBS都与VEGFR-2共定位,这提示在VEGFR-2存在的情况下,这些内皮细胞能产生内源性H2S。这为研究内源性H2S与VEGFR-2的作用及内源性H2S在心血管系统的作用打下了一定的基础。总之,我们深入研究了H2S促进内皮细胞血管新生的机制,特别是深入研究了H2S究竟如何激活其在血管内皮细胞上的靶分子VEGFR-2。首次证实：①VEGFR-2的Cys1045与Cys1024之间存在二硫键；②该二硫键是H2S作用于VEGFR-2的靶结构,可被H2S打断,从而提高VEGFR-2的激酶活性；③H2S打断VEGFR-2的作用是通过HS-的形式来发挥的；④在血管内皮细胞,VEGFR-2与产生内源性H2S的酶CSE、CBS共定位。
【作者】刘姝媛；
【导师】朱依纯；
【作者基本信息】复旦大学，生理学，2012，博士
【副题名】硫化氢靶分子VEGFR2的发现
【关键词】硫化氢；硫氢化钠；血管新生；内皮细胞；细胞迁移；VEGFR-2disulfidebond；ROS；CSE；CBS；

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