Th17/Treg细胞免疫调节平衡的变化在移植骨骼肌成肌细胞治疗急性心肌梗塞中的研究

【摘要】骨骼肌成肌细胞移植治疗心肌梗死是最有潜力的治疗措施,目前多项研究显示移植进入心梗区域的同种异体骨骼肌成肌细胞的存活率非常低,一般24小时后的存活率低于20%,这已经是不争的事实,严重的影响了骨骼肌成肌细胞的治疗效果。可能与同种异体骨骼肌成肌细胞移植进入心肌梗死区诱发的炎症和免疫反应相关。Thl7/Treg细胞之间的免疫调节平衡可能在炎症和免疫反应过程中起到重要作用,因此,我们的研究明确了在骨骼肌成肌细胞移植过程中诱发了Th17/Treg细胞之间的不平衡。VEGF不仅是血管形成的主要调节因子,而且在调节炎症反应中起到中要的作用。新型的纳米颗粒-高分支聚乙二胺(hPAMAM)作为一种非病毒的、低毒性的、高效的载体,产生炎症反应的作用很小,可以保护携带的基因免于蛋白酶的消化分解。因此,我们选择利用hPAMAM作为载体携带VEGF165基因转染骨骼肌成肌细胞,然后移植进入心梗区域,VEGF165可以在心梗区域缓慢的释放,达到长效的作用,有利于微血管的生成和生长,有利于炎症的缓解,从而缓解了Th17/Treg细胞之间免疫调节的不平衡。第一部分骨骼肌成肌细胞的分离、培养和鉴定,以及VEGF165基因的转染目的：分离C57BL/6小鼠的骨骼肌成肌细胞,并在体外进行培养、纯化和鉴定。将cDNA-VEGF165与表达载体纳米颗粒超支化聚乙二胺(hPAMAM)结合后,转染骨骼肌成肌细胞,检测最佳转染效率。方法：注射0.1ml布比卡因预处理激3-4周小鼠体内骨骼肌成肌细胞,48h后采用混合酶(II型胶原酶+dispease)一步消化法和Percoll非连续密度梯度法提取骨骼肌成肌细胞,然后采用反复差速贴壁法纯化骨骼肌成肌细胞。使用特异抗原desmin和a-sarcomericactin鉴定骨骼肌成肌细胞。分别将0.4ug、0.6ug、0.8ug的cDNA-VEGF165按照1：4、1：6、1：8、1：10、1：12的比例与hPAMAM结合,然后分别与2×104的骨骼肌成肌细胞共培养4h,使用活细胞实时监视仪Cell-IQ细胞培养平台观察转染hPAMAM-VEGF165表达载体的骨骼肌成肌细胞的生长情况和细胞数量变化,使用自由分布图像软件分析监测的数据。结果：骨骼肌成肌细胞呈现贴壁生长,分离后3天左右贴壁,7-9天左右可见逐渐融合生长,细胞呈长梭形、纺锤形,可呈线状生长,融合后可以形成肌管样结构。骨骼肌成肌细胞特异抗原desn(?)in和a-sarcomericactin呈阳性表达,流式细胞仪检测显示desmin阳性的细胞占82.34±2.96%,a-sarcomericactin阳性的细胞占80.1±3.39%,desmin和a-sarcomericactin双阳性的骨骼肌成肌细胞占81.22±3.23%。hPAMAM-VEGF表达载体转染骨骼肌成肌细胞的最佳转染条件是：VEGF165质粒的数量为0.4ug,V:N为1：8时,骨骼肌成肌细胞的增殖最接近正常细胞的生长,而且分泌的VEGF达到最大值。结论：采用混合酶一步消化法、Percoll连续密度梯度法和反复差速贴壁法可以得到数量较多和纯度较高的骨骼肌成肌细胞。hPAMAM表达载体可以携带VEGF165转染骨骼肌成肌细胞,可以作为一种新型的低毒性的非病毒载体。第二部分急性心肌梗塞动物模型的建立和移植骨骼肌成肌细胞治疗急性心肌梗塞目的：正确建立急性心肌梗塞模型,观察骨骼肌成肌细胞移植治疗急性心肌梗塞的可行性和有效性。方法：使用气体麻醉,左侧开胸的方式,直视下结扎前降支近端,形成急性前壁心肌梗塞,然后使用微量注射器分不同位点将骨骼肌成肌细胞注射进入心肌梗塞周围区域,分为急性心梗组(AMI组)、单纯骨骼肌成肌细胞移植组(AMI-S组)和转染hPAMAM-VEGF165的骨骼肌成肌细胞移植组(AMI-V组)。分别在术前、术后1d、术后1w和术后4w观察小鼠体重的变化。分别在术前、术后即刻、术后1w、术后4w使用心超测量小鼠心功能,观察EF的变化。然后在活体经肾静脉直接注射伊文氏蓝观察心肌梗塞的面积大小,取出心脏,使用TTC法观察心肌梗塞的深度和范围。心脏组织免疫组化染色观察心梗周围CD4+T淋巴细胞浸润的情况。结果：制作小鼠心肌梗塞模型的成功率约为86%。在术前,AMI组、AMI-S组和AMI-V组三组小鼠体重之间无明显差异。在术后1d,三组小鼠体重之间也未见明显差异。然而,在术后1w,与AMI组小鼠体重(16.58±0.35克)相比,AMI-S组小鼠体重(17.66±0.30克)和AMI-V组小鼠的体重(18.34±0.28克)均明显增加(P<0.05),而且,与AMI-S组小鼠体重(17.66±0.30克)相比,AMI-V组小鼠的体重(18.34±0.28克)显著增加(P<0.05)。在术后4w,与AMI组小鼠体重(16.50±±0.35克)相比,AMI-S组小鼠体重(18.23±0.34克)和AMI-V组小鼠的体重(18.97±0.18克)均明显增加(P<0.01),而且,与AMI-S组相比,AMI-V组小鼠的体重显著增加(P<0.05)。直视下可以清楚的看到心肌梗塞的位置和范围,梗死范围为左室前壁和心尖部,TTC实验显示心肌梗死贯穿全层。在术前,三组正常小鼠的左室EF未见明显差异(P>0.05)。在术后即刻,三组小鼠的左室EF也未见明显差异(P>0.05)。然而,在术后1w,与AMI组(31.54±3.23%)相比,AMI-S组(37.94±2.29%)和AMI-V组(46.28±2.44%)左室EF明显升高(P<0.05),而且,与AMI-S组相比,AMI-V组左室EF明显升高(P<0.05)。在术后4w,与AMI组(33.6±3.18%)相比,AMI-S组(56.28±±2.83%)和AMI-V组(63.73±3.33%)左室EF明显升高(P<0.05),而且,与AMI-S组相比,AMI-V组左室EF明显升高(P<0.05)。免疫组化染色可见心梗周围CD4+淋巴细胞浸润,在AMI-S组较为明显。结论：直视下冠脉结扎法可以有效地控制心肌梗塞的范围,小鼠的心肌梗塞位置和范围合适,符合实验的要求。移植骨骼肌成肌细胞和转染hPAMAM-VEGF的骨骼肌成肌细胞治疗急性心肌梗塞能有效地恢复心功能。第三部分Th17/Treg细胞免疫调节平衡的变化目的：探讨移植骨骼肌成肌细胞治疗心肌梗塞引起的Th17/Treg不平衡,探讨移植转染hPAMAM-VEGF165的骨骼肌成肌细胞治疗急性心肌梗塞时,Th17/Treg不平衡是否被缓解。方法：术后1d、2d、4d、7d,分别使用流式细胞仪检测脾脏内Treg细胞和Th17细胞的百分率,使用real-timePCR分析脾脏和心脏组织中Treg细胞相关转录因子Foxp3和Th17细胞相关转录因子RORγt的mRNA水平,使用Bio-plex悬浮芯片分析血清中Treg细胞相关的调节细胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10和Th17细胞相关促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17A,以及血清中VEGF的浓度。结果：在AMI组、AMI-S组、AMI-V组中,CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率、转录因子Foxp3mRNA水平、相关调节细胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10的浓度从手术后第一天开始呈现逐渐下降的趋势,到第7天的时候达到最小值。与AMI组相比,AMI-S组Treg的百分率、转录因子Foxp3mRNA水平、相关调节细胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10的浓度更低(P<0.05或者P<0.01),而AMI-V组Treg的百分率、转录因子Foxp3mRNA水平、相关调节细胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10的浓度更高(P<0.05或者P<0.01)。然而,CD4+IL-17+Th17细胞的百分率、转录因子RORγt的nRNA水平、相关促炎症细胞因子IL-1p、IL-6和IL-17A的浓度呈现逐渐上升的趋势,与AMI组相比,AMI-S组Th17的百分率、转录因子RORγtmRNA水平、相关调节细胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10的浓度明显升高(P<0.05或者P<0.01),而AMI-V组Th17的百分率、转录因子RORγtmRNA水平、相关调节细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17A的浓度显著降低(P<0.05或者P<0.01)。结论：骨骼肌成肌细胞移植治疗急性心肌梗死,可以引起Th17/Treg不平衡,可能导致移植的骨骼肌成肌细胞存活率下降,移植VEGF165基因可能缓解骨骼肌成肌细胞移植引起的Th17/Treg不平衡。
【作者】柳瑞军；
【导师】王春生；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2012，博士
【关键词】骨骼肌成肌细胞；Cell-IQ；超支化聚乙二胺(hPAMAM)；VEGF；转染；动物模型；心肌梗塞；射血分数(EF)；心功能；Treg；Th17；RORγt；Foxp3；免疫调节；转录因子；细胞因子；

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