E3连接酶APC/C~(Cdh1)介导BRSK2通过泛素—蛋白酶体途径进行周期性降解

【摘要】BRSKK1(SADB)和BRSK2(SADA)是AMPK家族中两个同源基因,在脑,睾丸和胰腺中特异表达。有研究表明,BRSK1磷酸化周期蛋白Wee1,Cdc25B和Cdc25C,从而调节Cdkl活性,最终抑制细胞周期进程。有文献报道BRSK2同样也能磷酸化Weel蛋白。最新的研究发现,BRSK1能磷酸化y-tubulin的Serl31,并认为BRSK1对Cdc25C的磷酸化调节是由细胞周期进程中BRSK1的活性变化调控的。而本文研究提出一个新的观点,BRSK2能通过蛋白水平的变化机制来调控细胞周期的进程。细胞要顺利通过细胞周期的各个进程需要非常复杂的信号通路的调控,包括各种调节因子的磷酸化和泛素化介导的蛋白降解事件的有序完成。细胞有丝分裂的有序进程需要有后期促进复合物／周期体(anaphase-promotingcomplex/cyclosome,APC/C)的调节,APC/C介导底物的降解需要共激活子Cdh1和Cdc20的激活作用,大部分被识别并降解的底物中都有降解子Dbox和／或KENbox的存在。通过亚细胞定位实验发现,内源BRSK2蛋白在有丝分裂期与γ-tubulin共定位。细胞阻滞和释放实验后都发现,BRSK2蛋白水平在G2/M期达到顶峰,G2/M期后逐渐下降,到G1/S又降至最低,结果表明BRSK2蛋白在细胞有丝分裂过程中是不稳定的。细胞经蛋白酶体抑制剂处理后,BRSK2的蛋白水平显著上调,而BRSK2的mRNA水平并没有明显的变化。实验还证明,BRSK2能够被泛素化,且用MG132处理后,泛素化水平显著增强。研究表明,不是APC/CCdc20,而是APC/CCdhl介导促进BRSK2蛋白的泛素化降解。干扰内源Cdh1后,引起BRSK2的蛋白水平上调。用放线菌酮处理细胞后,干扰内源Cdhl组的BRSK2蛋白半衰期比非干扰的对照组中的显著延长。进一步实验证明,在生理条件下,BRSK2与Cdh1相互作用,且在有丝分裂期亚细胞共定位,表明内源BRSK2与Cdhl在有丝分裂期形成复合体。经筛查发现,BRSK2蛋白氨基序列中含有2个典型的Dbox和1个KENbox,通过物种间同源比对发现,这3个box是非常保守的。实验鉴定BRSK2蛋白的降解是KENbox依赖的,而KENbox的突变增强了BRSK2蛋白的稳定性。超表达野生型BRSK2和KENbox突变体均能引起细胞G2/M期细胞增多。因此,我们首次发现并证明BRSK2通过泛素-蛋白酶体途径来调控细胞周期的进程。本文的第二部分还初步研究了新基因C19orf66的生物学功能。C19orf66蛋白属于UPF0515蛋白家族,资料显示,C19orf66基因在进化历史进程中,到半脊索海生生物Saccoglossuskowalevskii时开始出现。迄今为止,对于C19orf66的功能研究仍然很有限。有基因芯片数据显示,C19orf66在脑癌,肺癌等多种肿瘤组织中下调表达。根据已有的信息提示,我们开始对C19orf66进行初步的功能研究。C19orf66基因位于19号染色体上,基因全长2139bp,其开放阅读框(ORF)编码291个氨基酸。C19orf66基因定位在19p13.2,由7个外显子和6个内含子组成。对同源基因进行比对后发现,C1Porf66基因在脊椎动物中有很高的同源性。RT-PCR分析显示,C19orf66在人的不同组织中均有表达。在HeLa细胞中的亚细胞定位分析表明,C19orf66主要定位于细胞质中。通过信号通路研究发现,C19orf66显著下调Rb通路的活性。进一步研究发现,超表达和消减C19orf66均可促进肿瘤细胞发生凋亡。
【作者】李如伟；
【导师】余龙；
【作者基本信息】复旦大学，生化与分子生物学，2012，博士
【关键词】BRSK2；后期促进复合体；蛋白酶体；C19orf66；细胞凋亡；

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