H_2O_2氧化应激诱导椎间盘纤维环细胞衰老的研究

【摘要】目的①研究纤维环细胞的培养条件及生物学特性。②观察纤维环细胞在不同浓度的H202作用下氧化应激状态的不同。③明确P38MAPK抑制剂对氧化应激诱导的纤维环细胞生物特性的影响。④探讨P38MAPK抑制剂对氧化应激诱导的纤维环细胞基因表达的影响。方法①新西兰大白兔(2-3kg,雌雄不限)5只,无菌条件下分离纤维环,酶消化法联合组织块法含15%FBS的DMEM/F12(1:1)培养液培养,当细胞90%融合后进行传代培养。通过倒置相差显微镜观测细胞形态,台盼蓝染色测定细胞活力,甲苯胺蓝和HE等染色进行组织学观察,MTT法测定细胞增殖,分析纤维环细胞形态、活力、增殖特点。②纤维环细胞传第二代时进行实验。按照H202不同浓度(0μmol/L、130μmol/L216μmol/L、360μmil/L、600(μmol/L、1000μmol/L)进行分组,0μmol/LH2O2为空白对照组。在细胞对数生长期,不同浓度H202处理1h后原培养液继续培养48h,通过检测,分析比较各组与空白对照组间形态、活力、增值、周期的差异性。③纤维环细胞传第二代时进行实验。分空白组(不作任何处理)、对照组(360μmol/L、600μmol/L、1000μmol/L3种浓度的H202处理1h后换成原培养液)、实验组(同对照组H202处理1h后20μmol/LP38MAPK阻滞剂作用30min,然后换成原培养液)。48h后,通过检测,分析比较各组与空白对照组间形态、活力、增值、衰老相关-β-半乳糖苷酶活性、周期的差异性。④纤维环细胞传第二代时进行实验。分空白组(不作任何处理)、对照组(600μmol/LH2O2处理1h后换成原培养液)、实验组(同对照组H202处理1h后20μmol/LP38MAPK阻滞剂作用30min,然后换成原培养液)。48h后,通过逆转录PCR检测各组与空白组间P38、P53、P16、PRbmRNA的表达差异。结果①纤维环细胞22h后开始贴壁,细胞呈扇形,4d后完全贴壁,4-5d后细胞进入指数生长期。12d后可进行细胞传代。甲苯胺蓝染色显示细胞核具有异染性。三代以内细胞能够保持一定的细胞形态及生长状态,而三代以上的细胞形态开始改变,胞质内出现空泡,细胞增殖减慢。②与空白对照组比较,当H202浓度为130μmol/L,216μmol/L时,纤维环细胞生物学特性未见显著性改变(P>0.05)；当H202浓度为360μmol/L、600μmol/L、1000μmol/L时,髓核细胞出现衰老改变：细胞质减少并出现空泡、增值减慢、衰老相关-β-半乳糖苷酶蓝染率增加、细胞周期阻滞于G1期而进入S期减少(P<0.05)。随着H202浓度的增高,衰老程度不断升高。③P38MAPK的使用使纤维环细胞在浓度为360μmol/L、600μmol/L的H2O2处理后的氧化应激状态有所好转(P<0.05),而对1000μmol/LH2O2处理过的纤维环细胞无效(P>0.05)。④对照组的基因表达较高,与空白组及实验组相比数据具有显著性差异(P<0.05)。而空白组及实验组之间的数据相对较接近,P38、P16mRNA的表达数据相比较无显著性差异(P>0.05),但是P53、PRbmRNA的表达数据相比较具有差异性(P<0.05)。结论①在椎间盘细胞实验时,可选择第2代纤维环细胞进行实验,如此能够拥有足够实验细胞的同时保证稳定的细胞活性,不影响实验结果。②在纤维环氧化应激模型的建立时需采用360μmol/L(及以上)的H2O2浓度,这样才能导致纤维环细胞提前衰老,引起纤维环细胞生物学特性的改变并保证氧化应激模型造模成功。③P38MAPK阻滞剂能够有效干预纤维环细胞有限范围内的氧化应激状态。当纤维环细胞的氧化应激程度较高时,P38MAPK阻滞剂无法起作用,或是收效甚微。④可以证实P38、P16、P53、PRb是导致细胞衰老的重要信号因子,其存在于P38MAPK整个信号通路当中,P38MAPK阻滞剂的使用能够不同程度的抑制这些衰老因子的表达,从而延缓细胞衰老的进程,但不能使纤维环细胞恢复或是逆转到氧化应激之前的状态。
【作者】谢健；
【导师】童培建；
【作者基本信息】浙江中医药大学，中医骨伤科学（专业学位），2014，硕士
【关键词】氧化应激；纤维环细胞；细胞衰老；P38MAPK信号通路；H2O2；

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