GOD转基因酵母菌的构建及其重组GOD的表达分析

【摘要】近年来,葡萄糖氧化酶(简称GOD)的用途越来越多,需求量也越来越大。而目前其生产主要采用胞内表达的发酵体系,大多数存在生产成本偏高,产出蛋白纯度不够高,产量偏低等问题。因此,借助基因工程手段构建优良的GOD产生菌株,并让它有效的高表达,具有重要意义。本论文采用巴斯德毕赤酵母(菌株GS115)做为表达菌种。巴斯德毕赤酵母的表达系统分胞内表达和分泌到胞外两种方式,所用发酵培养基简单有利于分离纯化,可以用甲醇做为一般碳源严格地调控外源基因的表达。所以本实验用SacI内切酶鉴定所保存的真核分泌型表达载体质粒pPIC9K-His-GOD是否正确,重组质粒pPIC9K-His-GOD转化大肠杆菌扩增,提取并纯化。pPIC9K-His-GOD用BlgII内切酶线性化,电激转化毕赤酵母菌GS115,以期得到高分泌易于纯化的酵母工程菌株,提取核DNA进行PCR扩增确定是否转化成功。将得到的菌种做发酵表达,SDS.PAGE检测蛋白表达。本论文取得的结果主要有：1重组质粒pPIC9K-His-GOD转化大肠杆菌：选择SacI内切酶线性化重组质粒,检测保存的酵母表达载体pPIC9K-His-GOD,将得到的目的片段载入大肠杆菌通过碱裂解法和PEG纯化方法以获得高纯度的重组质粒pPIC9K-His-GOD.2重组质粒pPIC9K-His-GOD电转化巴斯德毕赤酵母GS115:根据酵母表达体系,将纯化的重组质粒pPIC9K-His-GOD用B1gⅡ线性化并电激转化毕赤酵母GS115,将目的基因整合到毕赤酵母染色体上。通过基因组PCR法进行验证是否整合,确定12个菌株基因组中有GOD基因整合。利用遗传霉素G-418筛选能稳定含有GOD基因的多拷贝酵母菌株,命名为p.PIC9K-GS115-GOD04.3巴斯德毕赤酵母GS115的发酵表达：根据毕赤酵母的特点,以及转化子的培养,应用甲醇做为唯一碳源和能源做诱导表达,之前实验室保存的黑曲霉基因组的GOD序列的5’端加有编码6个组氨酸的基因序列,故发酵后上清用三氯乙酸丙酮沉淀蛋白,粗酶液采用组氨酸标签纯化,简单快捷,为了确定胞内是否有少量的目的蛋白,用超声破碎沉淀细胞,用同样的方法检测,最后用SDS-PAGE对胞内胞外蛋白进行分析。
【作者】刘旻；
【导师】马建忠；
【作者基本信息】兰州理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】GOD；SDS-PAGE；pPIC9K-His-GOD；毕赤酵母GS115；大肠杆菌DH5α；

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