小鼠CD4相互作用蛋白的筛选与鉴定

【摘要】研究背景哺乳动物精子具有结合转运外源DNA的能力,精子介导基因转移（sperm-mediatedgenetransfer,SMGT）是一种简便、高效的生产转基因动物的方法。但该方法极大的随机性与不确定性成了SMGT广泛运用和推广的障碍,主要问题是对精子结合转运外源DNA的机理不明确。目前研究较少,且主要集中在精子膜CD4分子内化外源DNA上。CD4是精子质膜上的受体和转运候选分子之一,是-种单链跨膜蛋白,SMGT方法创始人Lavitrano教授和我们组前期研究都证实CD4分子在精子内化转运外源DNA的过程中发挥重要作用。但封闭CD4分子的精子仍部分具有转运外源DNA的能力,说明精子结合转运外源DNA不仅有CD4发挥作用,而是多个分子共同作用的结果。且蛋白质相互作用在生命活动中扮演关键角色,所以筛选鉴定与CD4相互作用、且在精子结合转运外源DNA中的重要分子,将为精子介导基因转移机理的研究开辟新的思路,最终为建立简单、稳定、高效的精子介导转基因方法学奠定基础。材料与方法本研究首先构建了诱饵载体pGB-mCD4,对其自激活效应进行检测。具体方法是：提取小鼠睾丸组织mRNA,通过RT-PCR获得mCD4基因片段,将mCD4与pGB质粒载体连接构建,阳性克隆进行质粒提取测序,对阳性克隆载体进行自激活检测。接着,利用酵母双杂交系统,采用转化法对小鼠睾丸cDNA文库进行筛选,对阳性克隆进行基因测序,序列分别利用GenBank比对,筛选与CD4相互作用的基因,并对其进行初步的生物信息学分析。最后,检测mCD4和4种候选分子在哺乳动物293FT细胞中的共表达情况。具体方法是：构建真核表达载体pCDEF-Myc-mCD4,pCDEF-FLAG-BSPRY,pCDEF-FLAG-RANBP9pCDEF-FLAG-CD320,pCDEF-FLAG-Creld2,将构建的载体转化至293FT细胞,转染48h,在荧光显微镜和FACS确认转染效率。对细胞裂解物进行了Westernblot验证。结果（1）构建了诱饵载体pGB-mCD4,mCD4的长度为123bp,经电泳、测序检测为目.的片段；诱饵载体转入Y190菌株,经β-galactosidase显色,表明pGB-mCD4不能自激活酵母细胞Y190。（2）睾丸cDNA文库的转库效率为9.3×105cfu/μg。转化酵母Y190后培养,有199个克隆在Leu-Trp-His-/SD+3AT培养基平板上生长,随后进行β-galactosidase显色反应分析,有26个克隆经过显色后变蓝,认定为阳性克隆。将26个酵母质粒转化细菌感受态后,在LB+Ampr平板中生长,再挑单克隆扩增细菌质粒。将得到的26个克隆细菌质粒与质粒pGB-mCD4质粒两两共转Y190酵母菌,随后再P-galactosidase显色反应分析,23个样品变蓝,分别将23条基因测序,利用GenBank进行比对,得到的8条阳性基因,分别为：BSPRY（登录号：NM138653.1）、Pmpcb（登录号：NM-028431.2）、RANBP9（登录号：NM019930.2）、Morc2b（登录号:NM177719.4）、Ggnbp2（登录号：NM153144.2）、CD320（登录号：NM019421.3）、Adam2（登录号：NM-009618.2）和Creld2（登录号：NM029720.2）。（3）构建了真核表达载体pCDEF-Myc-mCD4,pCDEF-FLAG-BSPRY,pCDEF-FLAG-RANBP9,pCDEF-FLAG-CD320和pCDEF-FLAG-Creld2,将构建的质粒载体共转化至293FT细胞,转染效率为97.7%。经Westernblot验证,其中BSPRY基因和RANBP9基因可以在细胞中稳定表达。结论利用酵母双杂交,筛选到8个小鼠CD4相互作用分子。
【作者】赵润泽；
【导师】赵永聚；
【作者基本信息】西南大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】小鼠；酵母双杂交；CD4；精子介导转基因；Westernblot；

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