融合抗原PstS1-LEP原核表达及血清学诊断

【摘要】背景：结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)引起的结核病死灰复燃,常规结核病化疗对耐药、耐多药结核病治疗效果降低。虽然结核病预防有卡介苗(BCG),治疗有一线、二线抗结核化疗药物,然而全球结核病疫情仍十分严重,仍然是世界公共卫生问题。结核病控制包括诊断、治疗、预防,随着分子生物学技术发展,不断发现用于结核病诊断和疫苗研制的M.tb抗原及其衍生抗原。目的：本研究通过大肠杆菌表达M.tb融合蛋白PstS1-LEP,并作为抗原,采用ELISA法检测结核患者、肺外结核患者、肺部疾病患者以及健康人血清学抗PstS1-LEPIgG抗体,旨在评价新融合抗原用于结核病血清学诊断的价值。方法：(1)利用在线数据库SYFPEITHI分析20个蛋白的抗原表位,筛选得分高12条Th表位肽,每条15个氨基酸,首尾相连组成一条多肽LEP,根据大肠杆菌偏爱的密码子设计编译LEP的碱基序列,由上海生物工程技术有限公司进行全基因合成(N端引入BamHI酶切位点和C端引入HindⅢ酶切位点)。目的基因经DNA测序验证正确后与pET-28a-pstsl载体相连,将重组质粒pET-28a-pstsl-LEP转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白。融合蛋白PstS1-LEP经DEAE阴离子亲和层析纯化并稀释透析复性。蛋白免疫印迹法(westernblotting)检测复性的PstS1-LEP蛋白与结核病患者来源血清和抗PstS1单抗反应；该蛋白作为抗原,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺结核患者、肺外结核患者、肺部疾病患者和入伍新兵来源的血清IgG抗体,旨在评价该蛋白在血清学诊断方面的价值。结果：人工合成了LEP蛋白编码基因,该基因克隆到PET-28a-PstS1载体,重组质粒经酶切鉴定,正确的重组质粒进行全基因测序表明与LEP编码碱基序列一致。重组PstS1-LEP蛋白在大肠杆菌中获得表达,离子交换层析获得较纯目的蛋白,复性后蛋白浓度为1.25mg/ml。PstSl-LEP与结核病患者血清和抗PstSl单抗呈阳性反应。肺结核患者血清中抗PstSl-LEPIgG抗体水平较高,显著高于肺外结核病组、肺部疾病组和健康人组(P<0.05)。208例肺结核患者和43例PPD-健康者血清IgGOD492nm.采用ROE分析确定临界值为0.43,PstSl-LEP用于血清学诊断的灵敏度和特异性、阳性预示值、阴性预示值分别为69.5%、68.4%、79.9%和55.3%；PstSl-LEP用于肺结核患者血清学诊断敏感度显著高于肺外结核(78.8%vs52.2%,χ2=23.60,P=0.000)。208例肺结核患者和46例肺部疾病患者血清IgG0D492nm采用ROC分析确定临界值为0.44,PstS1-LEP用于血清学诊断的灵敏度和特异性、阳性预示值、阴性预示值分别为67.9%、93.2%、94.8%和61.6%。采用不同对照进行ROC曲线分析获得不同的cutoff值,以肺部疾病组作对照,显著提高了PstSl-LEP血清学诊断特异度。研究发现接种BCG影响PstSl-LEP血清学诊断,因为卡痕组抗PstSl-LEPIgG抗体水平显著高于无卡痕组(P=0.008)；健康者皮试反应大小也影响PstSl-LEP血清学诊断,因为PPD皮试阳性健康组抗PstSl-LEPIgG抗体水平显著高于PPD皮试阴性健康组(P<0.05)。因此,BCG接种和Mtb感染均可能影响PstSl-LEP血清学用于活动性结核病的诊断；因此,该抗原虽然有一定诊断价值,但其诊断敏感度和特异度还不能满足临床诊断要求。结论：PstSl-LEP在大肠杆菌中表达并具有免疫原性,为进一步评价PstSl-LEP作为疫苗的候选抗原奠定基础。
【作者】邵进士；
【导师】何秀云；
【作者基本信息】西南大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】结核分枝杆菌；线性表位；原核表达；血清学诊断；

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