动物衣原体TaqMan-MGB探针多重荧光定量PCR方法的建立及应用

【摘要】动物衣原体病((Chlamydiosis)是由各类衣原体(Chlamydia)感染哺乳动物、禽类等动物所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病。该病呈地方流行,常造成较大的危害及经济损失。目前针对的衣原体的检测方法有细胞培养法、间接血凝试验(1HA)、直接染色观察等方法,但以上检测方法对于快速准确的检测衣原体尚存在较大的局限,如细胞培养法容易受到支原体的污染、灵敏度较低；间接血.凝试验虽然操作比较简单,但批次间差异较大、阳性检出率较低；直接染色观察灵敏度较低。因此,急需建立一种快速、简捷、特异、灵敏、稳定性好的检测方法,用于衣原体的早期诊断、疫情监控、流行病学调查等。为了保障畜牧业健康发展,加快现代畜牧业前进步伐,本研究以荧光定量PCR方法为技术基础,建立了一种能单管同时鉴别三种动物衣原体的TaqMan-MGB探针多重荧光定量PCR方法,该方法特异、灵敏且稳定性良好。主要研究内容包括以下几方面：1、通过对GenBank中衣原体科的9种衣原体主要外膜蛋白序列进行比对分析,应用PrimerExpress3.0生物学软件设计了3对特异的引物,3条探针和1对通用引物。采用通用引物进行PCR扩增,构建阳性质粒,将其阳性质粒测序结果与GenBank中已发表的主要外膜蛋白序列进行比对。结果表明：构建的阳性质粒与GenBank中发表的主要外膜蛋白序列相似性分别达达99%、97%、96%。2、通过对三种衣原体(家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体)的单重荧光定量PCR引物浓度、探针浓度和Tm值的优化,分别建立了家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体的单重荧光定量PCR检测方法。并进行了相应的特异性试验、灵敏度试验,建立了相应的标准曲线。结果表明：家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体单重荧光定量PCR方法仅对目的基因有扩增,对其它衣原体科的衣原体无特异性扩增。流产嗜衣原体单重荧光定量PCR方法最低检测量为1.6copies/μL；鹦鹉热衣原体单重荧光定量PCR方法最低检测量为1.6copies/μL；家畜嗜衣原体单重荧光定量PCR方法最低检量为2.8copies/μL。其建立的标准曲线方程扩增效率及相关系数分别为：流产嗜衣原体R2=0.9999、扩增效率为105.02%、Y=-3.2075x+39.051;鹦鹉热衣原体R2=0.999、扩增效率为101.7%、Y=-3.2815x+41.396；家畜嗜衣原体R2=0.9991扩增效率为109%、Y=-3.1245x+35.752；由此可见三种衣原体的单重荧光定量PCR方具有较高的特异性和灵敏度。3、在已建立的三种衣原体单重荧光定量PCR方法基础上,通过对引物浓度、探针浓度、退火温度的优化,建立了单管同时扩增家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体的多重荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果表明：该方法能特异性扩增三种衣原体的目的片段,而对其他衣原体均无特异性扩增；灵敏度试验结果表明：流产嗜衣原体最低检测量为2.5×10copies/μL、家畜嗜衣原体最低检测量为3.08copies/μL、鹦鹉热衣原体最低检测量为1.6×10copies/μL。三种衣原体多重荧光定量PCR检测方法建立的标准曲线方程、扩增效率、相关系数R2分别为：流产嗜衣原体R2=0.999、扩增效率为103.2％、Ch.abortusY=-3.242x+38.813;家畜嗜衣原体R2=0.999扩增效率为96.4%、Y=-3.41x+39.325；鹦鹉热衣原体R2=0.999、扩增效率为103.2%、Y=-3.24x+39.9。因此,本研究建立的衣原体多重荧光定量PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏度。4、分别采用本研究建立的多重荧光定量PCR方法与OIE推荐的PCR方法和已发表的动物衣原体套式PCR方法进行比较,分别对采自重庆地区的660份猪鼻腔拭子样品及960份猪阴道拭子样品进行检测,其阳性检出率分别为：OIE推荐的PCR方法检出阳性率分别为：20.9.%、25.8%；动物衣原体套式PCR方法检出阳性率分别为19.5%、24.9%；本研究建立的多重荧光定量PCR方法检出阳性率分别为20.3%、25.6%。结果表明：本研究建立的多重荧光定量PCR方法检出阳性率比OIE推荐的PCR方法的检出阳性率低0.8%；比动物衣原体套式PCR检测结果高1.5%,同时本研究所建立的检测方法能够同时鉴别家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体三种衣原体,但其它两种检测方法不能够同时鉴别区分三种衣原体。总之,本研究建立的多重荧光定量PCR方法能对单个或混合感染的衣原体样品进行快速鉴别诊断。不仅对衣原体的临床检测提供了科学的理论依据和技术支持,而且对衣原体的流行病学调查和防控具有重要的意义。
【作者】袁曾壮；
【导师】刘力；李应国；
【作者基本信息】西南大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】动物衣原体病；荧光定量PCR；检测方法；

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