棉花脱落酸8’-羟化酶基因的功能分析

【摘要】植物激素作为植物生长发育的调控物质,在棉花纤维的生长发育过程中具有非常重要的作用。多种植物激素(如生长素、赤霉素、油菜素类固醇和细胞分裂素)在纤维发育中的功能和调节机制已有较多的研究。相对于这些能促进植物生长的植物激素,脱落酸对棉花纤维发育的作用和作用机制却研究较少。脱落酸(Abscisicacid,ABA)是一种重要的植物激素,在植物生长发育和抗逆中发挥重要作用。纤维细胞是一种极度伸长的单细胞,在其发育过程中具有较高的ABA含量,但ABA在纤维生长发育中的作用和相关调节机制尚不清楚。植物内源ABA水平主要受合成和代谢两方面调控,前人研究认为ABA代谢是调控ABA水平的主要方面。代谢途径中的ABA8’-羟化酶(ABA8’-hydroxylases,ABAH)是ABA氧化分解的关键酶,负调节ABA的积累。因此,为了进一步探索ABA在棉花植株生长和纤维发育中的作用,解析ABA对纤维发育的调控机制,同时也为改良纤维产量和品质的基因工程提供更多的有效基因,本研究通过克隆棉花中ABAH基因的同源基因及其5’-调控序列,构建了目标基因的植物表达载体和启动子分析表达载体。首先在转基因番茄中明确了克隆基因的生物功能,命名为GhABAH;进而通过棉花遗传转化,在棉花中超量表达和反义抑制GhABAH,观测了转基因棉花中ABA水平和纤维的性状变化,分析了基因表达变化、ABA水平变化与纤维性状变异的关系,阐明GhABAH基因对纤维生长发育的作用,为进一步完善纤维细胞的生长发育理论提供了相关实验数据。主要结果如下：1.克隆棉花GhABAH基因克隆基因GhABAH的cDNA长1768bp,包含58bp的5’-UTR,一个1401bp的ORF和309bp的3’-UTR。推导的ORF编码466个氨基酸残基,分子量53kD,IP=9.254。与cDNA序列对应的基因组序列长2509bp,包含有7个外显子和6个内含子。在棉花D-亚基因组中有2个ABAH的同源基因(GrABAHl禾口GrABAH2),GhABAH与GrABAHl具有较高的相似性。GhABAH是一个膜结合蛋白,在N-端有一个长23AA的跨膜结构。该蛋白与其它物种中的ABAH有较高的同源性,与杨树ABAH相同性85%,相似性92%;与葡萄相同性85%,相似性93%；与拟南芥相同性79%,相似性88%；与蓖麻ABAH相同性85%,相似性92%。亲缘关系与可可和蓖麻最近。序列分析结果表明克隆的GhABAH是棉花中ABAH的同源基因。2.分析了GhABAH基因的表达特征基因的表达模式是揭示基因功能的重要数据。为了探索GhABAH与棉花植株和纤维细胞生长发育的关系,检测了该基因在棉花根、茎和叶等不同器官和组织以及纤维细胞不同发育时期的表达水平。结果显示GhABAH在棉花根中的表达远高于茎和叶中的表达。在纤维发育过程中,该基因在纤维伸长早期(开花后6天)有较高的表达量,随着纤维伸长速率的增加其表达量降低,在纤维快速伸长期(开花后12天)表达量最低,而后又逐渐增加,在纤维次生壁合成起始期表达量最高,说明该基因的表达具有纤维细胞发育时期特异性。同时GhABAH基因的表达受ABA诱导,而受油菜素内酯和生长素抑制。而且该基因在徐州142无绒无絮突变体和野生型开花前3天及开花当天的胚珠中表达差异明显,说明GhABAH也参与了纤维细胞分化和起始调控。GhABAH的表达模式表明该基因与纤维细胞的分化、起始、伸长和次生壁形成具有密切关系。3.通过转基因烟草分析了GhABAH基因启动子的功能为了准确了解GhABAH基因的时空表达特性和调控因素,我们克隆了该基因2013bp的5’-上游调控序列。该序列中包含许多光反应元件、增强子序列、厌氧反应元件、真菌反应元件、胚乳表达序列、防御和胁迫反应元件、ABA响应元件、乙烯反应元件等,表明GhABAH基因的表达受多种因素影响。通过启动子删除实验,构建了启动子分析植物表达载体并进行了烟草遗传转化。转基因烟草的GUS活性检测结果表明,上游1811bp和1094bp启动子在表达模式上没有明显差异,说明GhABAH启动子的核心区域位于1094bp内。该启动子控制的GUS基因主要在转基因烟草幼苗的根中表达,而在幼苗的茎和叶中皆无GUS信号。在成熟的转基因烟草植株中,GUS信号分布于根、茎、叶、花及表皮毛中,根中的信号主要在幼根中,茎髓部无GUS信号。由此说明GhABAH的表达具有一定的发育特异性和组织特异性。4.通过转基因番茄分析了GhABAH基因的功能通过在番茄中异源表达GhABAH基因,观察转基因番茄表型的变异和检测转基因番茄中ABA含量的变化,验证了GhABAH的生物学功能。结果显示转基因植株株高降低了29%,叶片萎蔫、易干枯、气孔无法正常关闭,叶片颜色变深,叶绿素含量增高72%-124%,花粉育性降低,果实内无种子或是种子数目减少,种子成熟和胚发育异常,果实着色和植株衰老提前,侧根数目增加102%,内源ABA的水平下降了57.89%。这些结果表明异源表达GhABAH可促进ABA的代谢、降低内源ABA的含量并影响番茄的生长发育,证明该克隆序列是一个有生物功能的基因。5.GhABAH表达水平的变化影响了棉花植株的发育对超量表达GhABAH基因TO代转基因棉花进行表型鉴定及生理生化检测,与野生型相比,转基因棉花内源ABA含量降低了63.1%,植株纤细,侧枝变短,叶片及棉铃变小；叶片严重萎蔫,气孔无法闭合；开花时间滞后,花瓣和萼片较小,花柱伸长,花粉粒没有散出,花粉的育性降低。同时,2001nMNaCl条件下T1代幼苗侧根数目增加了200%。相反,抑制GhABAH的表达使内源ABA含量增加了54.4%,T1代幼苗对ABA敏感性增高。说明GhABAH表达水平的变化可调节棉花内源ABA含量水平,影响植株的生长发育,揭示ABA对于植株的生长发育具有重要的调控作用。6.GhABAH表达水平的变化对棉花纤维生长发育的影响超量表达GhABAH使转基因棉花纤维突起及伸长均受抑制。转基因棉花成熟纤维长度(4#转化子为2.64±0.03cm)与野生型(2.97±0.02cm)相比缩短了11.1%,次生壁增厚,马克隆值增高31%,断裂比强度降低20%。同时,转基因棉花的纤维生长对ABA的敏感性降低、耐受性提高,5μMABA处理10天的转基因纤维(27%)受抑制程度明显低于野生型(57%)；ABA合成抑制剂则促进纤维伸长,但是转基因纤维长度的增加程度(23%-25%)明显低于野生型(43%-59%),说明适宜的ABA含量是纤维伸长所必需的；添加ABAH特异抑制剂则显著抑制纤维及胚珠的生长发育。相反降低GhABAH表达对成熟纤维长度影响不显著,但其次生壁厚度明显增加。结果说明GhABAH表达变化不仅影响纤维分化、起始和伸长,而且影响次生壁的形成。证明该基因在棉花纤维生长发育中有重要调控作用。
【作者】叶树娥；
【导师】罗明；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】GhABAH；脱落酸；棉花纤维发育；

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