蕹菜叶片过氧化物酶的分离纯化、酶学性质及固定化研究

【摘要】过氧化物酶(Peroxidase,POD,EC1.11.1.7)是一类在生物体内普遍存在的、由单一肽链和铁卟啉组成的血红蛋白类氧化酶,催化由H202参与的氧化反应,例如参与胺类和酚类化合物的氧化反应。POD在生物体内发挥多种重要功能,例如参与分解吲哚乙酸、合成木质素和植物体内防御反应。当今,该酶不仅广泛用于免疫印迹、酶联反应和电镜技术等生物学研究,而且在污水处理、生物传感器等领域发挥重要作用。以新鲜蕹菜为原料,经过匀浆、静置抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析等步骤,分离纯化获得电泳纯的蕹菜POD。该酶的比活力为35972.96U／mg,回收率为12.21%,纯化倍数达168.48。经过SDS-PAGE以及Superdex-200凝胶过滤层析,测定该酶的相对分子质量约为42.7KD。用过氧化氢及愈创木酚作底物测定蕹菜过氧化物酶的酶活,发现该酶最适温度为40℃,最适pH值6,并且在20～50℃及pH5-8的范围内具有良好的的稳定性。以不同浓度的H202为底物,测得该酶的Km值为18.32mmol/L。NaCl、Urea、Zn2+、Mg2+对该酶都具有较强的激活作用,SDS,KSCN、AsA、Ba2+、Mn2+、Fe2+、甲醇、乙醇、正丁醇和异丙醇对雍菜POD活力均有抑制作用,其中AsA对POD有极强的抑制作用,当浓度为0.01mol/L时,酶活力接近为0。选择特定的化学修饰剂,分别用乙酰丙酮、二硫苏糖醇、氯汞苯甲酸、顺丁烯二酸酐、氯胺-T、苯甲基磺酰氯、N-乙酰咪唑和溴乙酸选择性地对其进行化学修饰,并且测定修饰前后酶活力变化。结果表明：精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基和巯基是蕹菜过氧化物酶发挥活性的必需基团,而甲硫氨酸硫醚基、丝氨酸残基和酪氨酸酚羟基可能不是蕹菜过氧化物酶活性中心的必需基团。利用0.2%PVA-CA作载体,饱和硼酸作交联剂,CaCl2作固定剂固定蕹菜POD,通过单因素试验探究了各个因素对固定化的影响；再通过正交实验分析,发现在饱和硼酸-6%CaCl2、固定化时间为45min、载体与酶液比例为1：2和0.2%PVA-3％CA条件下固定化甘薯叶POD最佳。固定化酶的最适温度、温度稳定性均升高,并且重复使用7次后酶活还剩余50%以上。
【作者】王红扬；
【导师】唐云明；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】过氧化物酶；分离纯化；性质；功能基团；固定化；

【参考文献】
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