柑桔抗Alternaria alternata遗传分析及QTL定位

【摘要】由交链格孢菌(Alternariaalternata)引起的柑桔褐斑病是一种可同时危害柑桔嫩叶、嫩梢及幼果的病害。近几年在我国各大柑桔产区均有发生,且发病面积不断扩大,导致柑桔的产量和品质下降,造成严重的经济损失。目前,国内不同柑桔品种对褐斑病的抗性未见相关报道,与之相关的抗褐斑病基因认知不足,且缺乏快速稳定的致病力评价体系,进而影响病害的防治研究和实践。建立稳定的致病力评价体系,筛选出抗柑桔褐斑病品种,为生产防治和挑选经济适用品种提供参考；定位相关的抗性基因,从育种上根本解决这一问题成为当务之急。本研究采用室内接菌饼的方法建立一个快速稳定、操作简便的菌株致病力评价体系。并应用该体系对重庆4大主栽品种中的54个不同柑桔品种进行抗病性分析,采用不同评价方法进行抗性等级划分,明确不同柑桔品种对褐斑病的抗性。另外,以实验室已建立的柑桔分子标记遗传图谱为基础,利用“梨橙2号×晚蜜2号”及所得到的68株F1代为材料,以严重度(病斑直径大小)和发病率为指标,通过QTL定位到相应的标记位点。采用qPCR对部分标记基因进行分析。主要研究结果如下：(1)从万州红桔上采集柑桔褐斑病受害样本,在室内进行分离纯化和鉴定。研究发现菌落、菌丝、分生孢子形态特征与链格孢菌相似；接种致病产生黄色晕圈；以ITS1和ITS4为引物,扩增得到532bp的ITS区DNA片段。将测序结果登录GenBank进行BLAST比较,与A.alternata的相似性达到99%,以PG2和PG3(endoPG)区系列引物扩增序列构建进化树发现分离株与A.alternata聚为一枝。(2)首次在“温州蜜柑”离体叶片和果实上造成不同伤口处理,接种强致病菌株A.alternataHJX,25℃保湿培养后发现叶片不接菌对照有、无伤口均不发病；其余各种伤口处理均发病,不同伤口类型对病害影响很大。叶片反面较正面更易于发病,反面10针、1针及无伤接种发病无明显差异；果实表面1针、10针及去除果皮对发病影响达到极显著水平。用6个不同柑桔品种及AlternariacitriZYF,Alternariasp.MP32个菌株验证方法的稳定性及可靠性,发现菌株HJX在不同品种上致病力存在差异,2个菌株之间的致病力也存在差异。建议以离体柑桔叶片或果实为材料,叶片反面1针接种或果实去皮接种,25℃保湿培养2d后调查病斑大小,作为室内准确、快速评价柑桔褐斑病致病力的方法。(3)评价54个柑桔品种对褐斑病菌的感病程度及抗性分级标准。采用室内人工接种观察不同品种的感病程度并根据系统聚类法、平均直径法、病情指数法3种不同抗性评价方法来探讨54个柑桔品种对柑桔褐斑病菌的抗性。结果表明：参试的种质资源共分为高抗、抗病、中抗、感病、高感五类,未发现免疫种质；胡柚、强德勒、华盛顿脐橙和梁平柚4个品种为高抗品种；大多数宽皮柑类品种易感病。本研究本研究为指导田间栽培和抗柑桔褐斑病菌育种提供理论依据。(4)利用“梨橙2号×晚蜜2号”及衍生的68个LW重组自交系为材料,采用室内离体叶片接菌饼的方法,对其进行抗病性分析。并在已构建的含有334个SSR标记,9个连锁群,总长844.2cM,平均图距2.53cM的分子遗传图谱基础上,运用MapQTL5.0分析软件,采用区间作图(IntervalMapping)进行QTL初步检测,再利用多重区间作图法(MQM)进行优化,共检测到18个与柑桔识别抗性相关的标记,分布在LW2和LW3上,其中在LW2上检测到11个QTL位点,名为qlt2.1、qlt2.2、qlt2.3、qlt2.4、qlt2.5、qlt2.6、qlt2.7、qlt2.8、qlt2.9、qlt2.10、qlt2.11,贝献率分别为23.9%、23.2%、21.2%、20.4%、20.4%、20.2%、17.8%、17.8%、17.4%、17.3%、15.8%；LW3上检测到7个QTL位点,名为qlt3.1、qlt3.2、qlt3.2、qlt3.4、qlt3.5、qlt3.6、qlt3.7贡献率分别为25%、18.4%、18.2%、17.9%、16.7%、16.6%、16.4%。共检测到8个与柑桔防御抗性相关的QTL位点,其中在LW1上检测到2个位点,名为qlty1.1、qltyl.2,贡献率分别为18.2%和15.8%；LW2上为qlty2.1和qlty2.2,贡献率都为17%,qlty2.3贡献率为16.3%；LW3上是qlty3.1、qlty3.2贡献率分别为18.2%和17.4%；LW6上为qlty6.1贡献率为17.5%。合理利用与这些位点紧密连锁的固定标记cBSSR835E2、CMS30、Hcx4040、cSSR340、F13、cSSR202、F23、cSSR309、cBDM83E1、cBMM74、cSSR128、cSSR27、cSSR32、HCX6020、CMS14、Hcx6026、F88、LcSSR115对应的EST编码序列可促进抗柑桔褐斑病的分子标记辅助育种的发展。(5)选用中抗品种不知火叶片接种HJX对QTL标记LcSSR115、HCX6020、cSSR309、cSSR202、F88、cSSR340、cSSR32、Hcx4040所对应的EST编码序列进行qPCR分析,除HCX602和cSSR32表达量下调外,其余表达量均上调。此研究为进一步抗性基因的克隆和转化验证提供了理论依据。
【作者】刘荣萍；
【导师】胡军华；
【作者基本信息】西南大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】柑桔褐斑病；交链格孢菌；抗性；QTL；

【参考文献】
[1]王长柏.带中置式废热锅炉的氨合成塔的设计[J].石油化工设备.1989(05)
[2]马金海.大学英语学生英语阅读理解障碍及教学对策研究[D].西北师范大学,课程与教学论,2003,硕士.
[3]牛伟杰.基于有机朗肯循环的燃煤电厂低温余热回收技术研究[D].重庆大学,动力工程及工程热物理,2014,硕士.
[4]王记昌,邰鑫.一种物料分拣系统的设计[J].电子制作,2015,13:41.
[5]刘奇.0.6米×0.6米风洞级间分离与网格测力试验设计[D].重庆大学,仪器科学与技术,2014,硕士.
[6]刘建林.跨临界CO_2热泵地板辐射采暖系统研究[D].华北电力大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2012,硕士.
[7]何博.基于FPGA的MIC总线控制器研究[D].华中科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[8]李斌.玛曲县藏区特色农业保险开办模式探析[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[9]翟会会.废弃生物质与煤共制浆、气化及其铬元素迁移的研究[D].华东理工大学,化学工艺,2014,硕士.
[10]翟雷修.玛格丽特·阿特伍德《浮现》的生态女性主义解读[D].山东师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[11]张显,刘福斌,彭涛,李竹,庞博,耿建.电力用户与发电企业直接交易相关问题探讨[J].电力系统自动化,2014,13:33-37.
[12]王熙元.4路CDMA扩频通信同步系统FPGA实现[D].河北大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[13]宿华伟.沈丘县“三公开”工作调研[D].郑州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[14]翟亮.基于近红外激光光声光谱分析的变压器DGA技术研究[D].大连理工大学,光学工程,2013,硕士.
[15]杨熙.氧化石墨烯和石墨烯纳米材料制备及其重金属吸附性能研究[D].华中师范大学,2012.
[16]余斯亮.铝/钢异种金属冷金属过渡技术温度场应力场数值模拟[D].兰州理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[17]毛芳芳,王亚军,罗希,魏积福,郑裕国.具有非对映选择性还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选与鉴定[J].化学与生物工程,2012,07:12-16.
[18]赵素艳.橡胶沥青混合料路用性能及其温拌效果研究[D].吉林大学,交通运输工程,2014,硕士.
[19]顾维萌.我国保障性住房政策绩效审计评价研究[D].浙江工商大学,会计学,2013,硕士.
[20]张雪.基于内部控制的零售业X公司财务管理流程优化研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[21]汪兵.金属—肽段复合物在质谱中碎裂规律的研究[D].吉林大学,分析化学,2013,硕士.
[22]李鸿飞.人口红利的衰退对安徽省制造业出口的影响[D].安徽大学,国际商务,2014,硕士.
[23]易必特.数据仓库与电信行业决策支持（上）[N].人民邮电,2001-07-18005.
[24]李爽.中国保险公司次级债风险研究[D].辽宁大学,保险学,2012,硕士.
[25]王春霞,云健.网络教学平台上邮件智能分类系统的设计与实现[J].内蒙古师范大学学报(自然科学汉文版),2004,02:157-160.
[26]徐峥.广州乡村旅游发展研究[D].华中师范大学,农村与区域发展,2014,硕士.
[27]文斌.隐源性多灶性溃疡性狭窄性小肠炎临床特征荟萃分析及TNF-α在其肠组织中的表达[D].河北医科大学,内科学（专业学位）,2014,硕士.
[28]潘亮亮.蛛网膜颗粒结构特点及其脑脊液转运意义的形态学观察[D].河北医科大学,人体解剖与组织胚胎学,2013,硕士.
[29]李然.银行自助设备管理信息系统[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.
[30]杨琳艳.碱性成纤维生长因子与血管生成素相互作用机制的初步探究[D].东北师范大学,遗传学,2012,硕士.
[31]吉粉华.中国对外投资的产业——区位矩阵分析[D].苏州大学,世界经济,2003,硕士.
[32]徐亚明.基于嵌入式的车辆无线定位技术研究[D].陕西科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[33]崔彦辉.Nafion/NH_4-X沸石复合质子交换膜的制备与表征[D].哈尔滨工业大学,材料学,2013,硕士.
[34]吕乐.ERα共调节因子NCOR2和FOXA1基因多态性与2型糖尿病关联研究[D].吉林大学,流行病与卫生统计学,2014,硕士.
[35]田慧慧,苏玉鑫.机器人系统终端滑模重复学习轨迹跟踪控制[J].控制与决策,2014,07:1291-1296.
[36]杨玲.基于类ARM指令集的嵌入式片上系统验证[D].北京交通大学,2014.
[37]李忠南.MSCT肾动脉成像优化碘对比剂剂量及浓度的动物实验研究[D].辽宁医学院,影像医学与核医学,2012,硕士.
[38]赵玫,杨洪勇,李路伟.基于权重的目标覆盖控制算法[J].控制与决策,2014,10:1845-1850.
[39]曾雨竹,张仲超,曾继伦,许和平.改善有源电力滤波器系统动态性能的电压控制策略[J].电力系统自动化,2006,13:43-46+63.
[40]郄彦丽.高中思想政治教材“综合探究”研究[D].河北师范大学,教育,2013,硕士.
[41]吴明明.双管喉罩用于老年患者全身麻醉的临床研究[D].吉林大学,公共卫生,2012,硕士.
[42]张曦沐.采煤沉陷区稳定性区划与人居环境适宜性研究[D].中国矿业大学（北京）,岩土工程,2011,博士.
[43]曹咏春.Java可视表达和可视运行的研究与实现[D].广东工业大学,计算机应用,2004,硕士.
[44]陈志友.项目进度管理在攀龙变电站建设中的应用[D].厦门大学,项目管理,2014,硕士.
[45]孙娈.论路遥的爱情观[D].青岛大学,中国现当代文学,2004,硕士.
[46]董树锋,何光宇,张王俊,王治华.上海先进能量管理系统中的实时数据共享技术[J].电力系统自动化,2012,12:107-111.
[47]王金宽.黄壁庄水库移民问题研究[D].河北师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[48]高璐.正义论视角下沈阳市外来农民工就业问题研究[D].辽宁大学,行政管理,2012,硕士.
[49]张朝文.基于鱼眼图像的虚拟漫游及运动目标检测算法研究[D].东北大学,通信与信息系统,2011,硕士.
[50]郭利利.基于Agent的集成系统自适应演化模型的研究与实现[D].西安电子科技大学,计算机软件与理论,2011,硕士.