心脏Telocytes分子和功能特性及其心脏生物学研究

【摘要】新近研究证实一类新型的间质细胞存在,其特征是伴有长(数十至数千微米不等)而纤细(直径宽约0.1-0.5微米)的突起。该群细胞被命名为telocytes,其突起命名为Telopodes.迄今,在包括心脏在内的哺乳动物多脏器中已经发现Telocytes的空间分布。通过Telopodes,Telocytes能够与其他类别的心脏原位细胞,毛细血管或者神经末梢相互作用。并且,他们一同组成一个间质系统,能够起作用于心脏更新,再生以及修复。虽然一些与协调相关的功能在当前已有所研究,例如对心外膜干细胞池中的心肌祖细胞的调控以及在心肌梗死病理下血管新生,然而,涉及这些机制的系统化研究需要从心脏组织中纯化此类细胞。在Telocytes特有的细胞形态之外,其分子生物标记也已有所明确。相应于此,我们运用流式细胞仪,以其细胞膜表面CD34和CD117为分子靶向,成功的分离出心脏Telocytes。基于纯化细胞的基础上,此后相继开展了电生理、生物化学以及蛋白质组学技术从而进一步揭示此类细胞的基本特性。同时,也发现了心脏Telocytes能够通过旁分泌方式和促进微血管内皮细胞自分泌血管内皮生长因子方式来加快微血管内皮细胞增殖。上述发现必将为理解局部血管新生及心脏生理和防护提供新的理念。第一部分心脏Telocytes分离、培养、纯化、鉴定及培养基优化目的纯化心脏Telocytes并优化其培养基。方法利用6周龄的C57BL/6J小鼠,消化法分离心脏原位细胞,依据细胞间贴壁时间的差异,初步筛选并培养原代心脏Telocytes,借助流式细胞仪纯化原代中CD34+/CD117+表达细胞,激光共聚焦显微镜扫描Vimentin+表达及普通显微镜观察Telocytes特征形态。通过CCK-8对Telocytes在4种不同基础培养基：低糖DMEM伴10%胎牛血清、低糖DMEM伴20%胎牛血清、高糖DMEM伴10%胎牛血清、高糖DMEM伴20%胎牛血清,中增殖活力进行检测,优化适合Telocytes生长环境。结果原代培养细胞经流式细胞仪分析：CD34-/CD117-24.0%,CD34+/CD117-7.4%,CD34-/CD117+4.6%,CD34+/CD117+64%。CD34+/CD117+表达细胞在普通显微镜下观察其特异形态结构：细而长的细胞突起伴不规则串珠样膨起,这符合Telocytes的特征性的结构Telopodes;CD34+/CD117+表达细胞在激光共聚焦显微镜下可见骨架蛋白Vimentin在胞体和细胞突起的阳性表达,这符合TelocytesCD34+/CD117+/Vimentin+的特异性表达。在4种不同基础培养基中发现：高糖DMEM伴10%胎牛血清同低糖DMEM伴10%胎牛血清、低糖DMEM伴20%胎牛血清及高糖DMEM伴20%胎牛血清相比较,在1h至4hTelocytes的细胞增殖活力明显升高。结论在原代细胞培养的基础上采用CD34+/CD117+表达分选的细胞具备Telocytes特征性结构和蛋白表达,高糖DMEM伴10%胎牛血清为最优Telocytes的培养基。第二部分心脏Telocytes增殖、Telopodes演变及端粒酶活性分析目的时序性观察telocytes的增殖过程及telopodes的生长进程。方法利用6周龄的C57BL/6J小鼠,在心脏原代细胞培养的基础上采用流式细胞仪分选CD34+/CD117+表达的telocytes细胞,将其种植于6孔板中,借助Cell-IQ(?)imagingplatform定时(20分钟)连续(96小时)拍摄telocytes分裂增殖的全部过程以及在telocytes生长进程中细胞突起Telopodes的演变；选取与心脏telocytes同量的骨髓间充质干细胞、心脏成纤维细胞以及心肌细胞,通过实时定量PCR测定各组端粒酶浓度的差异。结果在活细胞成像平台下,贴壁的telocytes在12h开始进入界面构象,48h出现双核及胞体内陷的纵向分裂征象,56h可见特征性的telopodes伴随着子细胞向相反的方向移动而逐渐成形。在telocytes贴壁后的16h-24h,细胞特征性突起telopodes在伴随细胞生长进程中不断出现脱落和新生,脱落的telopodes分散成podoms和podomers,布满在telocytes周围空间。骨髓间充质干细胞、心脏成纤维细胞,心脏telocytes以及心肌细胞中端粒酶检测浓度分别为0.0668,0.1637,0.0974以及0.0006amoles/uL。结论纵向分裂的telocytes传代时程较长,端粒酶活性相对较低,细胞生长过程可见telopodes新生与脱落交替出现,并以podoms和podomers形式存在周围空间。第三部分心脏Telocytes电生理特性及蛋白质组学意义目的分析Telocytes的电生理特性及全细胞比较蛋白组学功能趋向。方法利用6周龄的C57BL/6J小鼠,在心脏原代细胞培养的基础上采用流式细胞仪分选CD34+/CD117+表达的Telocytes细胞,将其种植于GlassBottomDish,运用激光共聚焦显微镜扫描Na+,K+,Ca2+离子通道在细胞膜表达；将其种植于圆形载玻片上,在细胞外液140mmol/LNaCl,5mmol/LKC1,2mmol/LCaCl2,2mmol/LMgCl2,10mmol/LHEPES,12mmol/Lglucose,2mmol/LCoCl2,2mmol/L4-AP,2mmol/LBaCl2,pH7.4,以1.5mL/min的流速；细胞内液130mmol/LK-aspartate,6mmol/LNaCl,10mmol/LHEPES,2mmol/LMgCl2,14mmol/LEGTA,2mmol/LCaCl2,5mmol/LNa2ATP,pH7.4的环境下,保持电位为-40mV,自-110mV至+10mV,以阶差为20mV,运用全细胞膜片钳检测Telocytes的基本电生理特性。提取心脏Telocytes全细胞蛋白,运用同位素标签相对和绝对定量技术,质谱分析肽段并鉴定蛋白组分,同时,与心脏干细胞、心脏微血管内皮细胞及心脏神经嵴细胞之间蛋白定量比较,分析心脏Telocytes全细胞蛋白相对功能趋向。结果激光共聚焦显微镜扫描心脏Telocytes可见胞体及细胞突起膜表面Na+,K+,Ca2+离子通道分布表达；运用全细胞膜片钳技术将Ca2+染色指示剂Fura-2注入胞体观察到Telocytes特征性形态以及胞体强表达和podomers、podoms弱表达；刺穿细胞膜后检测Telocytes平均电容和平均电阻分别为22.53pF和15.65GΩ；自-110mV至+10mV诱发Telocytes,未见动作电位出现。心脏Telocytes与心脏微血管内皮细胞、心脏干细胞及心脏神经嵴细胞全细胞比较蛋白组学发现分别存在16,32及90个差异表达蛋白,Telocytes分别上调表达：细胞成分的形态发生(K2C7,CTRO),细胞内蛋白质运输(SNAG,FLOT2,GBLP),和代谢过程(GLO2,VPS4B);核mRNA剪接(SFRS5),代谢过程(NOL5A,IDH3A),免疫系统的过程(SAA3)和运输(FABP4);细胞运动(MYH9,ODFP2),细胞成分的形态发生(MYH9,LMNA,SPTA2,K1C13),细胞内蛋白质运输(RAB31,CHMP3,ARF3,NIPS1),细胞内氨基酸的生物合成和代谢过程(AL4A1,SCLY,AATM,MMSA,C1TC,GLSL,PROD2),免疫系统的过程(SODM,CATA,SBP1,MOSC2,GSTM1,PRDX6,THTR,DNJA3,BPHL,PPIA,EST31,GST01),蛋白合成与代谢过程(TCPQ,CH10,TCPB,UK114,CALR,TCPZ,TCPG),呼吸链电子传递和三羧酸循环(QCR1,ETFD,MDHC,ODO1,SUCB2,CP2CT)。结论心脏Telocytes膜表面存在Na+,K+,Ca2+离子通道,但没有动作电位发生,细胞间不以电信号传递；差异蛋白组学提示心脏Telocytes在细胞成分的形态发生等方面高表达。第四部分心脏Telocytes空间分布及其对微血管内皮细胞增殖影响目的观察心脏Telocytes与心脏微血管内皮细胞空间毗邻位置关系以及对其增殖的影响。方法将6周龄的C57BL/6J小鼠心脏,分离成1mm3大小,经4%戊二醛(pH7.3)在4℃固定4h,后经冲洗、梯度脱水、浸润、包埋,加工超薄切片(70nm),铺Formvar-coated铜网,醋酸铀和柠檬酸铅染色,透射电镜下观察心脏Telocytes形态及与心脏微血管内皮细胞空间毗邻位置关系。分离心脏Telocytes与心脏微血管内皮细胞,运用Transwell技术将两者共培养72h,采用碘化吡啶染色心脏微血管内皮细胞核,借助流式细胞仪分析共培养组及对照组心脏微血管内皮细胞之间细胞周期的差异。结果透射电镜下,心脏Telocytes位于心脏间质,心肌束之间,特征性结构Telopodes围绕在微血管周围,与微血管内皮细胞毗邻。Transwell技术共培养心脏Telocytes与心脏微血管内皮细胞发现：共培养组S+G2/M期15.3%+11.7%,对照组S+G2/M期11.8%+5.56%。结论心脏Telocytes与心脏微血管内皮细胞之间存在重要的毗邻空间位置关系,且心脏Telocytes旁分泌明显促进心脏微血管内皮细胞增殖。第五部分心脏Telocytes旁分泌及其促微血管内皮细胞自分泌研究目的分析心脏Telocytes旁分泌细胞因子、生物功能,及其对微血管内皮细胞自分泌血管内皮生长因子的影响。方法利用6周龄的C57BL/6J小鼠,在心脏原代细胞培养的基础上采用流式细胞仪分选CD34+/CD117+表达的Telocytes细胞,将其种植于6孔板中,贴壁后,无血清连续培养48h,分别在0,6,12,24和48h取上清液,运用细胞因子抗体芯片技术,定量检测120种细胞因子,选取48h时终浓度大于100pg/mL的细胞因子,并分析其参与机体生物功能。运用Transwell技术将心脏Telocytes和微血管内皮细胞共培养72h后,分别在2,6,12,24,48及72h收集微血管内皮细胞无血清培养基,采用酶联免疫吸附试验技术定量检测血管内皮生长因子含量。结果在48小时选取终点,36种细胞因子浓度大于100pg/mL,主要涉及免疫反应、炎症反应、信号转导、细胞间通信、化学因子、细胞粘附、凋亡、细胞增殖、生长发育及细胞表面受体相关转导方面,其中,1/3分泌因子与细胞生长相关。Elisa检测发现共培养组较对照组,在48h和72h时,微血管内皮细胞自分泌血管内皮生长因子明显增高。结论心脏Telocytes分泌细胞因子参与多种反应,细胞生长相关占主位；心脏Telocytes旁分泌作用能直接促进微血管内皮细胞自分泌血管内皮生长因子释放。
【作者】李华；
【导师】葛均波；
【作者基本信息】复旦大学，心血管内科学，2013，博士
【关键词】Telocytes；Telopodes；CD34~+/CD117~+；Vimentin~+；CCK-8；时序性；活细胞成像系统；podoms；podomers；全细胞膜片钳；同位素标签相对和绝对定量；质谱分析；Transwell技术；空间毗邻位置；细胞周期；细胞因子抗体芯片；酶联免疫吸附试验；旁分泌；自分泌；

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