血管紧张素（1-7）对大鼠肾小球硬化的保护作用及其机制研究

【摘要】第一部分血管紧张素(1-7)对5/6肾切除大鼠的保护作用目的：ACE2-血管紧张素(1-7)-Mas轴具有对抗肾素-血管紧张素系统,抗增生和抗纤维化特性。本研究拟观察血管紧张素(1-7)单独或联合ARB药物对5/6肾切除大鼠肾脏的保护作用。方法：1.雄性SD大鼠行Sham和5/6肾切除手术。分组：假手术组(Sham组,n=6)、5/6肾切除组(Nx组,n=6)、血管紧张素(1-7)治疗组(Ang(1-7)组,24μg/kg/h,皮下微泵埋置,n=6)、Ang(1-7)+氯沙坦治疗组(A+L组,n=6)和氯沙坦治疗组(Losartan组,10mg/kg/d灌胃,n=6)。8周后测大鼠尾动脉血压及收集24小时尿液检测尿蛋白,检测Scr水平和RIA法检测血浆Ang和Ang(1-7)含量。2.PAS染色观察肾脏病理变化；免疫组化检测肾小球硬化指标Fibronectin(FN)和CollagenI(ColI)的表达；DCFDA法检测肾组织ROS产物的表达。3.Real-timePCR检测Mas受体和PAI-1mRNA水平；Westernblot法检测肾组织FN、血管生成素(Ang)-Tie-2以及p47-phox和p67-phox的表达水平。结果：Ang(1-7)组、Losartan组和A+L组均可改善Nx组大鼠尿蛋白、血肌酐水平,升高血浆Ang(1-7)含量,减轻肾小球的硬化程度,降低肾小球硬化指标(FN、PAI-1和ColⅠ)和ROS表达以及NADPH氧化酶(p47-phox和p67-phox)活性。Ang(1-7)组改善尿蛋白、血.肌酐、硬化指标作用弱于A+L组和Losartan组,对血压、Ang-1/Ang-2比值无影响。Losartan组显著升高血浆AngⅡ水平,对Ang-1/Ang-2比值无影响。A+L组改善5/6肾切除大鼠肾损伤较Ang(1-7)组和Losartan组更显著。结论Ang(1-7)具有拮抗AngII的作用而改善5/6肾切除大鼠肾损伤,Ang(1-7)和氯沙坦双向阻断Angll的作用,对延缓慢性肾脏疾病的进展有更好的保护作用。第二部分Ang(1-7)对AngⅡ诱导系膜细胞纤连蛋白表达的影响目的：Ang(1-7)在肾小球固有细胞如系膜细胞中抗纤维化作用尚不明确。本研究拟观察Ang(1-7)对抗AngⅡ诱导系膜细胞FN的表达及其具体机制。方法：1.体外培养小鼠系膜细胞,应用Westernblot方法观察Ang(1-7)处理AngⅡ诱导细胞后FN表达情况以及Losartan阻断AT1同时给予Ang(1-7)后FN表达情况。2.体外培养小鼠系膜细胞,细胞生长融合至50%时,向6孔板中分别转入500nMMas特异性干扰RNA(MassiRNA)和空载对照干扰RNA(VehiclesiRNA),处理24小时后,根据不同分组,分别向6孔板中加入Ang(1-7)、AngⅡ和DX-600,应用Westernblot和Real-timePCR方法检测FN的表达的情况。3.体外培养小鼠系膜细胞,应用免疫共沉淀法观察细胞转染VehiclesiRNA和MassiRNA后,AT1和Mas的表达情况以及两者相互关系。结果：1.Ang(1-7)对AngⅡ诱导系膜细胞FN蛋白表达增多无影响。2.MassiRNA干扰Mas表达或给予DX-600减少Ang(1-7)的生成均可明显增加AngⅡ诱导细胞FN的表达(P<0.05)。3.在无外源性AngⅡ的情况下,Ang(1-7)本身较对照组FN表达无差异,而阻断AT1后,Ang(1-7)显著减少FN的表达(P<0.05)。4.AT1与Mas之间可形成复合物的中间状态。结论：在无外源性AngⅡ的情况下,Ang(1-7)拮抗AngⅡ诱导FN表达,而Ang(1-7)对外源性AngⅡ诱导系膜细胞FN表达增多无影响,可能与两者受体之间形成AT1-Mas复合物中间状态的解离有关。第三部分Ang(1-7)对肾小球血管生成素-Tie-2系统的影响及机制研究目的：血管生成素-Tie-2系统为肾小球固有细胞(内皮细胞,足细胞)特有的血管生成系统之一。Ang(1-7)具有抑制血管生成的作用,而此效应在肾小球细胞中未见报道。本研究拟观察Ang(1-7)对肾小球血管生成素-Tie-2系统的影响及其可能机制。方法：1.体外培养小鼠肾内皮细胞,运用Matrigel凝胶法观察内皮细胞管腔形成能力。2.体外培养小鼠足细胞和内皮细胞,运用Real-timePCR法检测不同剂量Ang(1-7)或AngⅡ对足细胞表达Ang-1和内皮细胞表达Ang-2的影响。3.体外培养小鼠足细胞和内皮细胞,在无或有外源性AngⅡ的情况下,根据不同分组,分别给予Ang(1-7)、Losartan、Mas受体阻断剂A-779和ERK1/2阻断剂PD98059,运用Westernblot法检测Ang-1、Ang-2及受体Tie-2表达以及eNOS磷酸化、ERK1/2磷酸化水平。结果：1.在无外源性AngⅡ条件下,Losartan能协同Ang(1-7)抑制血管生成素-Tie-2的表达。在有外源性AngⅡ条件下,Ang(1-7)抑制血管生成素-Tie-2的表达更显著(P<0.05),Losartan、A-779和PD98059能逆转Ang(1-7)对血管生成素-Tie-2的表达的抑制作用(P<0.05)。2.Ang(1-7)本身激活eNOS信号通路(P<0.05)；在有外源性AngⅡ条件下,Ang(1-7)致内皮细胞eNOS磷酸化显著减少,ERK1/2磷酸化明显增加,而给予NO合成酶抑制剂L-NAME,增加的ERK1/2磷酸化受到明显抑制(P<0.05)。结论：Ang(1-7)本身抑制血管生成,对抗内源性AngⅡ促生长作用；Ang(1-7)与外源性AngⅡ共同作用,通过下调eNOS而激活ERK1/2信号通路显著下调血管生成素-Tie-2的表达,协同抑制内皮细胞生长,Losartan能逆转此效应。
【作者】许成燕；
【导师】顾勇；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】ACE2-血管紧张素(1-7)-Mas轴；Ang(1-7)；慢性肾脏病；系膜细胞；Mas受体；AT1受体；血管生成素-Tie-2；eNOS；ERK1/2；

【参考文献】
[1]宁立.基于数据仓库的Web日志挖掘研究与应用[D].湖北大学,系统分析与集成,2012,硕士.
[2]周博曦,孟昭勇,王志臣,姜维,万全.基于CIM的变电站与配电馈线一次接线图自动绘制算法[J].电力系统自动化,2012,11:77-81.
[3]胡帅.白菜蛋白磷酸酶2C基因BcABI1的分离与表达分析[D].浙江大学,园艺学,2012,硕士.
[4]刘宁.山东半岛城市群城镇化与工业化协调发展状况分析[D].中国地质大学（北京）,应用经济学,2013,硕士.
[5]惠卫军,董瀚,高惠菊,马瑞卿.轿车螺旋悬挂弹簧用钢的研究开发[J].钢铁.2002(10)
[6]梁明国.烟台BW机械有限公司发展战略研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[7]袁晟.飞行器稳定装置集成技术的研究[D].南京航空航天大学,航空宇航制造工程,2013,硕士.
[8]谢立新.桥机起升机构的参数化设计及动态仿真分析[D].太原科技大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[9]姚武斌.玩具移用法和挖掘潜力法在物理实验教学中的实践[J].物理教师,2003,05:33-34.
[10]曾友良.高中化学学习中相异构想及其转变策略的研究与实践[D].湖南师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[11]崔嘉超.客车车身振动与车内声场耦合分析[D].东北大学,机械电子工程,2009,硕士.
[12]张会娟.电价引导下电力产业链综合节能优化模型研究[D].华北电力大学,技术经济及管理,2014,博士.
[13]田密.车载智能化电源管理系统的研究[D].浙江工业大学,2012.
[14]史赛云.初中教师教学互动决策的研究[D].山西师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[15]袁丽敏.合作学习在高中英语阅读课中对学困生学习行为的影响[D].首都师范大学,学科教学,2014,硕士.
[16]于慧媛.文字商标近似认定的语言学分析[D].中国政法大学,法学理论,2014,硕士.
[17]岳东山.医药物流中心规划与设计的研究[D].武汉理工大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[18]尹页秀.基于GIS的城市配电网规划[D].天津大学,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[19]官志平.基于ARM9的Linux系统移植以及在电梯轿厢内人数检测的应用[D].厦门大学,控制工程,2014,硕士.
[20]李红霞.银杏内生真菌次生代谢产物及其促进小麦抗低温活性研究[D].南京农业大学,农药学,2013,硕士.
[21]龚小彪.基于TLD框架的目标跟踪算法研究[D].西南交通大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[22]范乐.微流控芯片上血细胞全自动计数、分选和检测研究[D].大连海事大学,生物物理学,2013,硕士.
[23]王昕.叠层片式电感器电感稳定性研究[D].电子科技大学,电子信息与工程（专业学位）,2012,硕士.
[24]潘思彤.女性视角下的性别关怀[D].江苏师范大学,艺术学,2013,硕士.
[25]陈翠翠.知识产权滥用的反垄断规制研究[D].复旦大学,法律,2012,硕士.
[26]曾勇,杨煜普,赵亮.基于局部均值与类均值的近邻分类[J].控制与决策,2009,04:547-550+556.
[27]熊小芳.医学生诚信道德培养研究[D].南昌大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[28]陈露.BMP9和13对C3H10T1/2细胞心肌样分化及改善心梗后大鼠心功能的影响[D].重庆医科大学,儿科学,2014,博士.
[29]张亚妹.新型农村社会养老保险筹资机制研究[D].江西农业大学,政治经济学,2012,硕士.
[30]杨根科,吴智铭.多服务器排队网络的规则行为[J].自动化学报,2002,06:943-948.
[31]薛海超.农村小学生错别字纠正策略初探[D].河北师范大学,教育,2012,硕士.
[32]陈欢.论湖南桑植地区民歌的艺术特征及影响[D].云南艺术学院,MFA,2013,硕士.
[33]马攀攀.猪圆环病毒2型ORF2截短基因的原核表达及其单克隆抗体的研制和应用[D].河南农业大学,预防兽医学,2012,硕士.
[34]沈志强.高校教师教育技术能力现状、问题与对策研究[D].东北师范大学,教育技术学,2012,硕士.
[35]宫业竹.青岛地摊经济发展现状及管理对策研究[D].中国海洋大学,公共管理,2011,硕士.
[36]栗润德,张鸿儒,刘维宁.地铁引起的地面振动及其对精密仪器的影响[J].岩石力学与工程学报,2008,01:206-214.
[37]李春飞.基于ARCH族模型的中国与欧美股市的相关性分析[D].哈尔滨工业大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[38]崔元鑫.基于虚拟样机技术的某前置前驱轿车建模与平顺性仿真分析[D].吉林大学,车辆工程,2013,硕士.
[39]王志伟.降低硅基微元阵APD暗电流结构优化的研究[D].哈尔滨工业大学,光学,2014,硕士.
[40]熊亚丽.柔性挂接光电功能基团的间苯二酚杯芳烃衍生物的合成与表征[D].郑州大学,材料学,2013,硕士.
[41]郭小龙.高技术企业突破性技术创新与渐进性技术创新选择策略研究[D].北方工业大学,企业管理,2014,硕士.
[42]穆金霞.微流控芯片在两相有机合成中的应用研究[D].浙江大学,2007.
[43]郑旭煦.NeuromedinU2受体激动剂高通量筛选模型与天然产物活性成分研究[D].重庆大学,2003.
[44]任新洁.数字化教育资源规划策略研究[D].西安电子科技大学,情报学,2004,硕士.
[45]杨沛.基于DSP数字锁定放大器的双通道地沟油检测法[D].沈阳工业大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[46]戴璐.青虾养殖技术效率研究[D].南京农业大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[47]贺智博.浅谈如何防范会计造假[J].品牌(下半月),2015,02:58.
[48]刘晓晖.基于中文语音交互的虚拟装配技术研究[D].北京交通大学,2014.
[49]周晟.基于扫描链重排序的低功耗测试方法研究[D].湖南大学,软件工程,2012,硕士.
[50]王毅.赤道中印度洋经向海流与热量输运经向结构的季节变化及动力机制[D].中国海洋大学,物理海洋学,2014,博士.