小型猪自体移植肾灌注短效Caspase-3小干扰RNA冷保存导致肾损伤加剧的机制初探

【摘要】目的：在小型猪自体肾移植模型中探究短效Caspase-3小干扰RNA(smallinterferingribonucleicacid,siRNA)在体内外研究中实验结果相悖的机制,进一步探讨短效Caspase-3siRNA对凋亡通路蛋白caspase-3活化的影响,阐明短效Caspase-3siRNA的激活固有免疫反应机制,为其临床转化提供理论依据与实验基础。方法：选择25-30kg雄性广西巴马小型猪12只,随机分为I/R组6只(I/R),Caspase-3siRNA组6只(IR+siRNA)。建立小型猪原位自体肾移植模型,根据前期研究,左肾切取后siRNA组应用预配40mlUW器官保存液+0.3mg短效Caspase-3siRNA(合成序列5’-GGGAGACCUUCACAAACUUtt-3’与5’-AAGUUUGUGAAGGUCUCCCtg-3’)加压灌注,I/R组应用UW器官保存液同样加压灌注,冷藏24小时,移植前留取冷藏后肾脏穿刺标本,再移植到右肾原位。各组于缺血再灌注后48h切取肾脏组织标本。应用realtimePCR检测各组肾脏组织中Caspase-3mRNA及Toll样受体信号通路下游相关炎性因子的mRNA相对载量,应用westernblot检测各实验组小型猪肾组织中前体Caspase-3、活化型Caspase-3的表达水平。应用westernblot方法检测各组肾组织中TLR-3、TLR-7、TRIF、MyD88、PKR、RIG-1、HMGB1蛋白的表达水平。结果：自体肾移植48小时后,IR+siRNA组肾脏组织内TLR-3、TLR-7、MyD88、TRIF、PKR蛋白含量均较IR组有显著上升,半定量结果具有统计学差异；IR+siRNA组肾脏组织中,Toll样受体信号通路下游相关炎性细胞因子mRNA水平较IR组有明显升高,结果具有统计学差异；免疫印迹法检测Caspase-3蛋白载量,半定量结果显示：移植前穿刺标本,siRNA组较I/R组Caspase-3蛋白载量明显减少(吸光度OD值1.02±0.24vs.2.32±0.28,p<0.01),但移植后48h肾脏标本,siRNA组较I/R组Caspase-3的17kD活性裂解片段明显增多(OD值：0.22±0.04vs.0.06±0.01,p<0.05)移植后48小时,IR+siRNA组肾脏组织标本中HMGB1的蛋白载量显著高于IR组,半定量结果具有统计学差异。结论：本研究中应用的人工合成的siRNA能有效沉默局部Caspase-3mRNA转录Caspase-3蛋白,在冷保存过程中有效减少细胞凋亡,但移植后肾脏的损伤反而有所增加,凋亡细胞增多,活性Caspase-3裂解片段水平上升；造成这一结果的主要原因是由Toll样受体系统识别外源性siRNA,触发启动了机体的系统性炎症反应,增强了局部组织的炎性损伤与细胞凋亡；这一损伤作用能够持续至48小时,可能的机制为负反馈循环作用以及HMGB1蛋白参与了后续的循环级联放大炎症反应及细胞凋亡过程；siRNA疗法作为新型干预手段,在临床应用前仍需进一步消除其系统性副作用。
【作者】薛寅佳；
【导师】朱同玉；
【作者基本信息】复旦大学，临床医学（专业学位），2013，博士
【关键词】肾脏缺血再灌注损伤；小型猪自体肾移植模型；小干扰RNA；Toll样受体；

【参考文献】
[1]杨相配.基于学生满意度视角的民族院校本科教学质量研究[D].中南民族大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[2]刘博宇.义务教育经费最低保障标准的指标体系研究[D].首都经济贸易大学,统计学,2014,硕士.
[3]刘强,刘璨,朱文锋.数据挖掘:心气虚证的鉴别诊断研究[J].福建中医药,2005,03:5-6.
[4]熊莉.ZnO基纳米复合材料的制备及其光催化性能的研究[D].南京邮电大学,信息材料,2013,硕士.
[5]张亚娟.几种化合物对虾类抗氧化酶系统的影响与毒性作用[D].河北大学,水生生物学,2003,硕士.
[6]王超颖.广告的科技信息卖点研究[D].吉林大学,新闻与传播（专业学位）,2014,硕士.
[7]王燕燕.小孔腐蚀早期电流波动规律研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[8]王洪晏.使用微型机的检测装置和检测电路(讲座二)[J].冶金自动化,1985,03:41-47.
[9]储敏.聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS）修饰壳聚糖纳米粒作为抗肿瘤药物传递载体的研究[D].华中科技大学,药剂学,2012,硕士.
[10]宗春燕.低剂量微波辐射诱导博来霉素致小鼠DNA损伤的适应性反应研究[D].苏州大学,卫生毒理学,2014,硕士.
[11]宁德.学习《土地登记办法》的几点思考[J].南方国土资源.2008(06)
[12]仲继范.受贿罪量刑规范化研究[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[13]宋航.松花粉醇提物对小鼠食欲及脂质代谢的影响[D].山东师范大学,细胞生物学,2013,硕士.
[14]刘彬.十二指肠完全旷置术对非肥胖2型糖尿病Goto-Kakizaki大鼠糖代谢的影响[D].福建医科大学,外科学,2014,硕士.
[15]朱勇.试论奥古斯都的道德法令[D].东北师范大学,世界史,2012,硕士.
[16]张超.石墨烯复合材料的制备、结构及性能研究[D].复旦大学,2013.
[17]张娟.生物技术专利的审查制度研究[D].宁波大学,民商法（专业学位）,2013,硕士.
[18]赵建玲.散发性结直肠癌中p53、γ-H2AX和TP表达与Kras的关系及意义[D].山西医科大学,病理学与病理生理学,2013,硕士.
[19]罗华.地方政府对台招商引资管理问题研究[D].南昌大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[20]宋雪松.一种利用阵元结构信息ULA波达方向估计方法的研究[D].吉林大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[21]李志强.苊并杂环类化合物S1在急性髓系白血病中的分子药理机制研究[D].大连理工大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[22]张晓磊.水库移民政策历史演进研究[D].中国地质大学（北京）,公共管理,2014,硕士.
[23]张蔚.合同法领域中的比较过错理念[D].对外经济贸易大学,国际法学,2004,硕士.
[24]林倩如.ALA-PDT对Hela和Caski细胞增殖凋亡机制的初步探讨[D].复旦大学,妇产科学,2012,硕士.
[25]户海印.中国民用航空制造业目标定位及发展路径研究[D].北京交通大学,2015.
[26]李慧莹,吴大荀,柴天佑.钢铁企业制造执行系统研究[J].冶金自动化,2003,05:34-39.
[27]郭志勇.秦汉传食制度考述[D].郑州大学,秦汉史,2013,硕士.
[28]阿不都拉江·那斯尔.甜菜碱盐酸盐及三聚氰胺的合成方法研究[D].山东大学,应用化学,2013,硕士.
[29]赵耕云.基于MC9S12XS128的智能车辆的关键技术研究[D].长安大学,车辆工程（专业学位）,2013,硕士.
[30]李磊.基于MG2455的高速ZigBee系统搭建[D].华中师范大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[31]赵桂平.折射率梯度引起反转的光自旋霍尔效应研究[D].湖南大学,2012.
[32]张清.利用油页岩半焦制备微生物肥料的研究[D].吉林大学,环境工程,2014,硕士.
[33]陈楠.带动量项的粒子群优化算法及仿真实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[34]周剑一.第三人代为履行若干问题研究[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[35]杨敏,王志坚,尹燕敏.水文时间序列相似性挖掘系统[J].计算机系统应用,2001,09:46-47.
[36]李刚.SW公司绩效考核方案优化设计[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[37]记者杨佼.股权激励临近石墨烯助涨中国宝安股价[N].第一财经日报,2012-01-13A14.
[38]蒋红莲.论民法上的优先权[D].华东政法学院,民商法,2003,硕士.
[39]黄速建,刘建丽.中国企业海外市场进入模式选择研究[J].中国工业经济,2009,01:108-117.
[40]王小晟,吴顺祥.对几种处理不确定性信息的理论的比较研究[J].计算机工程与应用,2005,12:51-55.
[41]夏旭丹.利率市场化背景下农村信用社贷款定价研究[D].内蒙古农业大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[42]唐建宁.自然灾害应急联动预警系统的设计与实现[D].华南理工大学,软件工程,2012,硕士.
[43]谭甜源,姜齐荣,季建辉,乐健.并联型有源电力滤波器的安全保护系统设计[J].电力系统自动化,2007,12:81-85.
[44]潘俊.工程项目绿色施工管理研究[D].重庆大学,技术经济及管理,2014,硕士.
[45]李光.振冲法在软弱地基加固的应用[J].中国住宅设施.2003(07)
[46]曹仁清.高校学生党员发展和管理工作的创新研究[J].浙江工业大学学报(社会科学版),2013,02:121-125.
[47]刘政荣.PPGIS及其在加拿大安大略省核废料处理选址项目中的应用[J].武汉大学学报(信息科学版),2005,01:82-85.
[48]刘仁杰.伊维菌素、双羟萘酸噻嘧啶咀嚼片在犬的药动学及药效学研究[D].扬州大学,基础兽医学,2011,硕士.
[49]王明珏.中文网络语言中脏话的使用情况研究[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[50]方雯.我国积极财政政策的动态作用机制和有效性的实证研究[D].吉林大学,数量经济学,2004,硕士.