脑胶质瘤细胞放疗抵抗的分子机制研究

【摘要】脑胶质瘤是一种恶性程度高并且预后差的脑部肿瘤,占脑部全部肿瘤的50%以上。目前脑胶质瘤的标准治疗方法是最大程度的切除肿瘤,然后经过放射治疗,同时辅以替莫唑胺化疗,这样可以显著地增加患者的生存期,但是仍有多于90%的患者复发,并且表现出强烈的放化疗抵抗。为了更好地了解脑胶质瘤放疗抵抗的分子机制,我们按照临床放疗标准对脑胶质瘤细胞T98G单克隆进行gamma射线照射总剂量60Gy后挑选8个放疗抵抗单克隆,采用表达谱芯片和拷贝数变异芯片分别检测照射前后差异表达的基因和CNV片段,比较不同单克隆间差异表达的基因和CNV片段,并结合两种芯片的结果筛选候选基因进行易感性和功能研究。两种芯片的结果都表现出8个单克隆中差异表达的基因或者CNV片段既有相同的部分,又有各自特异的方面。表达谱结果中差异表达的基因数目最多的单克隆中有3473个差异基因,最少的有168个。CNV芯片的结果中差异CNV片段最多的单克隆中有380个,最少的有235个。分别统计两种芯片中差异基因的数目及出现频率,表达谱数据中总共有4303个差异表达的基因,其中有199个与TCGA数据库中报道的跟生存期相关的基因一致,这些差异的基因在5个以上单克隆中出现的共有4个基因,分别为S100A4、BMP2、LGALS3和NNMT.CNV数据中差异CNV区域包含的基因共有14215个,其中含有最多数目的单克隆中有7274个基因,最少的单克隆中有3103个基因。两种芯片中共同存在的差异基因共有1243个,其中在6个单克隆中都出现的有两个基因(ATP6V1D和SAT1),在5个单克隆中出现的基因有4个,在5个单克隆中出现的基因有13个。表达谱数据中热图的结果显示,脑胶质瘤细胞8个单克隆可以分为2个大支。GO分析分别统计了每个单克隆中差异最显著的前30个项目,其中在多个克隆中都富集到的项目有溶酶体、ECM与受体相互作用、细胞黏附、Wnt通路、TGF-β通路、乏氧与p53、氨酰-tRNA合成以及谷胱甘肽代谢等,通路分析的结果与GO分析的结果一致。CNV芯片的LOH结果显示,T98G细胞总共有23个LOH区域,片段大小从3M到108.9M不等,A549细胞总共有21个LOH区域,片段大小从4.2M到95.6M不等。两者共有9个CNV区域相同。与T98G细胞相比,不同单克隆中差异的LOH区域的数目也各不相同,其中相同的片段主要集中在1、7、8和16号染色体。单亲二倍体(UPD)的分析中,我们发现T98G对照细胞在9号和17号染色体存在UPD,但是放射前后没有变化,而A549细胞没有检测到UPD的存在。基于表达谱芯片和CNV芯片的结果,我们筛选出LGALS3基因作为功能研究的候选基因。LGALS3基因在5个单克隆中表达上调,并且在5个单克隆中拷贝数增加,两种芯片中有3个单克隆中既表达上调,同时又存在拷贝数增加,而且LGALS3的表达量还跟生存期相关,因此被选为候选基因,进行功能研究,由于辐射是脑胶质瘤发生的一个重要的危险因素,因此我们同时研究LGALS3基因的遗传多态性与脑胶质瘤发病风险之间的关系。LGALS3基因是半乳糖凝集素家族的一员,在细胞间、细胞质以及细胞核内都有表达,参与了细胞不同的生物功能,如增殖、细胞黏附、血管生成和凋亡等,在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用,但是在脑胶质瘤的研究不多。为了研究LGALS3基因遗传多态是否跟脑胶质瘤的患病风险相关,我们在华东地区收集了961例经神经病理诊断为胶质瘤的病人和1351例的健康对照人群,对LGALS3基因的5个标签SNP位点进行基因分型,探讨LGALS3基因的遗传多态性对脑胶质瘤患病风险的影响。单位点分析发现,rs4644位点的突变纯合型AA对比于野生型CC可以显著的增加脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR=2.15,95%CI=1.25-3.72,P=0.006。在隐性模型中,AA基因型对比于CC+CA基因型可以显著的增加脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR=2.10,95%CI=1.22-3.62,P=0.007。rs4652位点突变纯合型CC与野生型AA相比能够增加脑胶质瘤的发病风险,校正后的OR=1.29,95%CI=1.00-1.67,但是P值处于临界状态0.054。分层分析中,rs4644位点的AA基因型在男性和GBM中都可以显著的提高脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR值分别为2.07和2.81,95%C1分别为1.04-4.12和1.46-5.38。rs4652位点的CC基因型在女性和GBM中显著的增加患病风险,校正后的OR值分别为1.56和1.44,95%CI分别为1.03-2.37和1.01-2.06。以上结果显示,LGALS3基因的两个错义突变的功能位点与中国人群脑胶质瘤遗传易感性相关。根据易感性研究的结果,我们分别构建了LGALS3基因中两个SNP位点rs4644-rs465的A-C和C-A两种基因型的慢病毒过表达质粒,同时构建了干扰质粒,研究LGALS3基因在脑胶质瘤细胞增殖、化疗敏感性、迁移以及周期的变化。结果显示,过表达和干扰LGALS3基因可以明显的改变T98G细胞的形态,使细胞呈现细长型。从增殖实验的结果中可以看出,与对照组细胞相比,过表达AC和CA基因型可以明显的提高细胞的增殖能力,但是干扰组细胞与对照组细胞相比没有显著的差异。在不同的细胞株中加入化疗药替莫唑胺后,AC基因型的细胞的生存率明显高于其他组,这与克隆形成率的结果一致。CA基因型的细胞与对照组细胞没有明显的差异,干扰组细胞的存活率明显的低于组别。细胞迁移的实验中,过表达AC和CA的细胞的迁移速度明显的快于对照组和干扰组,干扰组细胞几乎没有发生迁移。细胞周期检测的结果发现,过表达和干扰LGALS3基因都会使脑胶质瘤细胞T98G的S期和G2期细胞比例增多,G1期细胞比例减少。本研究主要采用表达谱芯片和CNV芯片分别从RNA和DNA水平上探讨了脑胶质瘤细胞放疗抵抗的分子机制,筛选出了与放疗抵抗相关的基因和CNV片段,并选取了其中的LGALS3基因进行功能研究,发现LGALS3基因与脑胶质瘤的发病风险显著相关,并且在脑胶质瘤细胞的增殖、迁移以及化疗抵抗等具有重要的作用,表明LGALS3基因在脑胶质瘤的发生、发展以及预后中都有重要的作用,其具体的分子机制有待于进一步的研究。
【作者】宋晓；
【导师】卢大儒；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2013，博士
【关键词】脑胶质瘤；T98G细胞；gamma射线；表达谱芯片；CNV芯片；LOH；UPD；LGALS3；生存期；增殖；化疗敏感性；迁移；周期；

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