小分子化合物AICAR维持胚胎干细胞多能性的机制研究

【摘要】胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）是从早期囊胚内细胞团分离而出的多能性细胞。这些细胞能够体外培养无限增殖，维持自我更新，并且在特定条件下可以分化成为机体几乎所有类型的细胞。因此，ES细胞被认为是研究早期胚胎发育最重要的模型。对ES细胞的多能性维持和定向分化的研究能够为胚胎发育，再生医学和器官移植等临床医学研究提供重要的理论指导。在ES细胞中，多能性和定向分化的平衡被严格调控并处于一个相对稳定的状态。而这种平衡的维持，既需要转录因子及其构成的信号调控网络的调控，也有着来自表观遗传方面的调节，而microRNA（miRNA）作为一种重要的表观调控机制在ES细胞的多能性维持和分化调节中发挥着重要的作用。研究发现，强烈的外部刺激，例如瞬间的低pH值胁迫，低氧胁迫等，均有利于诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPS细胞）的形成。5-氨基咪唑-4-甲酰胺-呋喃核糖苷（5-Aminoimidazole-4-carboxamideribonucleotide，AICAR）是一种膜通透性的AMP-激活的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）的激活剂。它可以作为AMP的类似物，在不影响ATP，ADP和AMP水平的条件下激活能量代谢调控的关键蛋白激酶AMPK，从而抑制合成代谢，使细胞处于能量胁迫状态，影响ES细胞的多能性维持，但是其在ES细胞干性维持中的作用尚不清楚。本研究对AICAR处理及未处理的J1小鼠ES细胞进行研究，旨在揭示AICAR在ES细胞干性维持中的作用。主要的研究内容及结果如下：1.AICAR与白血病抑制因子（leukaemiainhibitoryfactor，LIF）共同作用可维持J1小鼠ES细胞的形态，同时能够上调ES细胞标志基因的表达。在J1细胞的细胞培养液中加入终浓度为1mM的AICAR，并以培养液中加入相同体积DMSO的ES细胞作对照。碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）染色结果表明AICAR处理的ES细胞表现出更高的AP活性。免疫荧光染色和实时定量PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，real-timePCR）结果显示AICAR能够上调Nanog，Oct4，Sox2和Klf4这些干性标志基因的表达。此外，尽管AICAR不能在缺少LIF的情况下单独维持J1细胞的干性，但是它能够拮抗维甲酸（retinoicacid，RA）诱导的ES细胞的分化。2.全基因组基因表达谱分析表明AICAR有利于J1小鼠ES细胞的多能性维持。对AICAR处理后的J1小鼠ES细胞提取RNA进行表达谱芯片分析，以寻找AICAR的下游调控基因，并进一步揭示AICAR在ES细胞干性维持中的作用。芯片数据证明，AICAR能够显著上调干性相关基因的表达，同时也能下调分化相关转录因子的表达。利用筛选得到的基因，在DAVID（DatabaseforAnnotation，VisualizationandIntegratedDiscovery）在线软件上面进行GO（GeneOntology）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）分析，发现AICAR不仅能够影响AMPK通路，同时也能影响其它与J1小鼠ES细胞的干性维持相关的通路，如BMP，MAPK和TGF-β通路等。3.AICAR可通过促进BMP通路从而拮抗RA诱导的ES细胞分化，利于其多能性维持。利用Real-timePCR对AICAR处理及未处理的细胞中Bmp2，Bmp4及其下游调控基因Ids，Coch，Dusp9进行检测，发现这些BMP通路相关基因的表达均上调。同时，AICAR还能够抑制RA诱导的上述基因表达的下调。Dorsomorphin（Dorso）是BMP通路的抑制剂，而其对AICAR作用的抑制进一步表明AICAR能够通过激活BMP通路来维持ES细胞的多能性。4.AICAR影响J1小鼠ES细胞的表观遗传修饰。AICAR能够通过调控表观遗传相关基因，如Dnmt3a，Dnmt3b，Smarca2，Mbd3，Arid1a的表达，从而影响ES细胞的表观修饰状态。实验结果表明，AICAR处理后全基因组DNA甲基化（5-methylcytosine，5mC）水平下调，而DNA羟甲基化（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）水平保持不变。对于组蛋白修饰而言，AICAR处理导致组蛋白3第9位赖氨酸乙酰化（histoneH3lysine9acetylation，H3K9Ac）水平的下调和组蛋白3第27位赖氨酸三甲基化（histoneH3lysine27tri-methylation，H3K27me3）水平的上调。此外，AICAR通过调控长的居间非编码RNA（longinterveningnon-codingRNA，lincRNA）的转录，从而影响ES细胞的表观遗传修饰状态。5.小RNA（smallRNA，sRNA）高通量测序结果表明AICAR能够显著影响对ES细胞发育具有重要作用的miRNAs的表达。我们对比了经AICAR处理的J1小鼠ES细胞和未经处理的J1细胞中miRNAs的表达模式，并利用Real-timePCR验证了这些差异表达的miRNAs，同时对多能性和分化相关的miRNAs和它们的靶标做了相互验证。结果表明大量多能性维持相关的miRNAs表达上调，而分化相关的miRNAs表达下调。6.miR-134表达的下调在一定程度上促进了干性基因的表达。miR-134是分化相关的miRNA，在RA诱导的ES细胞分化过程中表达显著上升。与对照相比，AICAR处理的细胞中，miR-134的表达显著下调，而其靶标Nanog和Sox2的表达则上调。过表达miR-134导致干性基因Nanog，Oct4，Sox2和Klf4表达的下调，而AICAR的加入使靶标基因Nanog和Sox2的表达呈现回升趋势。7.靶向Myc基因的miRNAs的预测及验证。Myc在AICAR处理后显著下调。为了探索Myc基因表达下调的原因，我们利用TargetScan和miRanda两个数据库对可能靶向Myc的miRNAs进行了预测，并筛选了其中在AICAR处理后表达上调的miRNAs进行进一步的验证。结果证实miR-34a，34b，34c能够在J1小鼠ES细胞中抑制Myc的表达，而miR-135b和miR-340也可能直接靶向Myc基因mRNA的3非编码区（untranslatedregion，UTR）调控其表达。总之，本研究表明AICAR的加入利于J1小鼠ES细胞的自我更新和多潜能性的维持，这将为ES细胞在医学上的研究及应用提供一定的理论基础。
【作者】史晓燕；
【导师】郭泽坤；
【作者基本信息】西北农林科技大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】AICAR；ES细胞；miRNA；多能性；转录因子；

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