新型化学杂交剂筛选及其诱导油菜雄性不育的效果和机理研究

【摘要】油菜是我国及世界主要的油料作物之一，其杂种优势显著。化学杀雄是油菜杂种优势利用的重要方式之一，新型高效化学杀雄剂（又称化学杂交剂，CHA）的筛选及其诱导雄性不育的机理是其重要的基础工作。本文选取三种我国具有自主知识产权的新型磺酰脲类除草剂单嘧磺酯钠、单嘧磺酯、单嘧磺隆作为候选药物，对其诱导油菜雄性不育的效果进行探索；然后选用诱导油菜雄性不育效果最好的单嘧磺酯钠溶液处理油菜，诱导其雄性不育，研究其诱导的雄性不育花药的细胞学变化、蛋白质组学变化。本研究旨在筛选出新型高效的油菜CHA，并探讨其诱导油菜雄性不育的机理，为新型CHA的研发以及应用提供理论依据。研究得到的主要结果如下：1、三种新型磺酰脲类化学药物诱导油菜雄性不育的效果经过2年多次试验发现，在甘蓝型油菜主花序最大花蕾长度为1-2mm时，叶面喷施0.05～0.10μg/mL单嘧磺酯钠和单嘧磺酯溶液，单株受药量为10mL时，均可较好地诱导油菜雄性不育。通过对不育株率、株高、单株产量等农艺性状进行统计和考察，发现适宜浓度的单嘧磺酯钠（MES）溶液诱导油菜雄性不育的效果优于单嘧磺酯溶液。单嘧磺隆溶液诱导油菜雄性不育的效果不佳，不适合作为油菜CHA。在油菜主花序最大花蕾为1-2mm时，对供试的49个油菜品种叶面喷施0.10μg/mL单嘧磺酯钠溶液（单株受药量为10mL），除品种“220”外，其它48个油菜品种均有一定程度的诱导雄性不育的效果；其中18个油菜品种全不育株率高达90%以上，7个品种一次喷药后诱导雄性不育的效果能持续到终花期。通过对49个品种的主要农艺性状考察，发现叶面喷施0.10μg/mL单嘧磺酯钠溶液对49个品种的株高、角粒数有一定的负面影响，但是对单株产量没有明显影响。2、单嘧磺酯钠溶液诱导油菜雄性不育株花药的细胞学变化显微结构和超微结构观察显示：0.10μg/mLMES诱导油菜雄性不育，不育花药的小孢子和绒毡层发育异常可发生在花粉发育的各个时期，到成熟期时所有花粉全部失活败育。败育特征主要包括：花粉母细胞时期绒毡层和小孢子细胞部分解体、四分体时期绒毡层解体或异常膨大、小孢子内含物逐渐解体或收缩成一团无可辨认的细胞器、单核期小孢子内含物完全解体只剩花粉外壁或小孢子发育畸形内含物收缩、绒毡层细胞部分提前解体或形状异常、成熟期的花药中绒毡层提前解体或是延迟解体个别绒毡层凝结成块，花粉囊中只剩一些空的或是只有一些细胞残余的败育花粉。3、单嘧磺酯钠溶液诱导油菜雄性不育花药的蛋白质组学变化通过对IPG线性胶条的pH范围、蛋白质上样量以及凝胶染色方法的优化发现：以pH4-7的线性IPG胶条进行等电聚焦，11%的SDS-PAGE进行第二向电泳，蛋白质上样量为800μg，用胶体考马斯亮蓝染色（CCB）可获得重复性好、分辨率高的油菜花药蛋白质组的双向电泳（2-DE）图谱；同时，该体系也适合于油菜叶片和油菜花蕾蛋白组的分离。在此基础上，通过2-DE技术分析比较了甘蓝型油菜对照株（可育株）和0.10μg/mL的MES诱导的雄性不育株的叶片、小花蕾、中花蕾的花药和大花蕾的花药的蛋白质组变化。结果发现，与对照组相比，在MES诱导的雄性不育株的叶片、小花蕾、中花蕾的花药和大花蕾的花药中分别鉴定出9、8、24和100个差异表达的蛋白质点。经肽质量指纹图谱（PMF）分析，在叶片、小花蕾、中花蕾的花药和大花蕾的花药中分别成功鉴定了9、8、24和90个差异蛋白质点；这些差异蛋白主要涉及细胞营救、防卫、解毒（13.8%）、蛋白合成、折叠和修饰（12.5%）、碳代谢（10.0%）、细胞运输（9.4%）、能量代谢（7.5%）、细胞骨架（6.9%）、核苷酸代谢（5.0%）、氨基酸代谢（5.0%）、次生代谢（5.0%）、信号转导（4.4%）、发育分化（4.4%）、细胞壁重塑和代谢（3.9%）、DNA加工（3.8%）、脂类代谢（3.1%）等多个代谢过程。通过对这些差异蛋白质分析发现，在MES诱导的油菜雄性不育植株叶片中有6个蛋白点上调，3个蛋白质点下调；上调蛋白质点主要参与胁迫应答和自身修复，下调蛋白质点主要参与能量代谢；MES处理并没有对叶片组织生长状态及生化代谢产生明显影响。在MES诱导的油菜雄性不育植株的小花蕾中有3个蛋白质点上调，5个蛋白质点下调；下调蛋白质点主要是参与植物生长发育和细胞静态骨架，其下调表达导致花粉母细胞期间少数绒毡层细胞和小孢子异常发育。在MES诱导的油菜雄性不育植株的中花蕾的花药中有4个蛋白质点上调，20个蛋白质点下调；上调蛋白质点主要涉及胁迫应答；下调蛋白质点主要参与植物生长发育，细胞壁重塑代谢，细胞静态骨架，细胞内运输，以及脂类、碳水化合物、能量代谢等；许多参与基因表达调控、细胞壁重塑代谢、细胞内运输的蛋白表达下调，从而导致四分体时期到单核靠边期的小孢子细胞和绒毡层细胞异常发育或是缺失。在MES诱导的油菜雄性不育植株的大花蕾的花药中有23个蛋白质点上调，77个蛋白质点下调；上调蛋白质点主要涉及碳水化合物、脂类和DNA降解代谢；下调蛋白质点主要参与细胞营救、防卫、解毒，细胞壁重塑，细胞骨架，细胞运输，和蛋白质、碳水化合物、脂类以及DNA生物合成代谢；其中大量参与碳水化合物，脂类以及DNA降解的蛋白上调表达，以及大量参与大分子合成蛋白的下调表达，造成发育花药代谢紊乱，导致成熟期花粉发育异常，花粉败育。根据MES诱导油菜雄性不育的细胞学变化和蛋白质组学变化的研究结果，本研究提出了一个生理变化和生化代谢网络变化模型可以初步解释MES诱导油菜雄性不育的机制。总之，本研究首次报道了0.05～0.10μg/mL的单嘧磺酯钠、单嘧磺酯溶液可以作为油菜化学杂交剂诱导油菜雄性不育；研究揭示了适宜浓度的MES诱导油菜花药败育的细胞学特征；利用比较蛋白质组学方法分析了对照可育株和MES处理诱导的雄性不育株的叶片和不同发育时期的雄配子体（小花蕾、中花蕾花药和大花蕾花药）的蛋白质组变化。在此基础上，本研究首次初步提出了MES诱导油菜雄性不育的生理生化代谢变化及诱导雄性不育的机制。这些研究结果为新型油菜化学杂交剂单嘧磺酯钠的开发和推广应用提供了理论依据；为揭示化学杂交剂单嘧磺酯钠诱导油菜雄性不育的分子机制提供了重要信息。
【作者】成宇峰；
【导师】赵惠贤；胡胜武；
【作者基本信息】西北农林科技大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】甘蓝型油菜；化学杂交剂；雄性不育；细胞学；蛋白质组学；

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