微生物对丹参毛状根生长和次生代谢的影响及其机理

【摘要】丹参是一种大宗的传统中药材，由于丹参次生代谢物在防治心脑血管疾病方面疗效确切，使得含有丹参成分药品的需求量不断上升。但传统种植方法受到地域、连作障碍和土传病害的影响和限制，无法保障原料药供给。丹参毛状根体系被认为是一种替代传统种植方法生产丹参次生代谢物的潜在途径，但在正常情况下，毛状根中的目标次生代谢物含量偏低，在本研究采用内源和外源微生物干预丹参毛状根的次生代谢，旨在提高丹参毛状根中的次生代谢物含量，并探索其作用机理及诱导规律，为使用代谢工程手段提高丹参毛状根中次生代谢物含量提供依据。论文的主要结果如下：（1）密旋链霉菌Act12发酵液和菌丝体能显著影响丹参毛状根的初生和次生代谢过程。将在高氏1号培养基中培养了9天的密旋链霉菌Act12的发酵液和菌丝体（StreptomycespactumFermentationFiltrateandMycelium，SpFFMy）一起加入到培养了21天的丹参毛状根中后，2%SpFFMy接种后丹参毛状根生物量变化不大，但4%SpFFMy却对丹参毛状根的生长稍有抑制；SpFFMy对毛状根中可溶性总糖的积累具有促进作用，2%SpFFMy处理最多使毛状根中的可溶性糖含量较对照增加了23.2%，但SpFFMy对丹参毛状根中的可溶性蛋白的积累则有抑制作用，4%SpFFMy处理最多使毛状根中的可溶性蛋白含量较对照减少了18.0%；SpFFMy处理显著促进了丹参酮在毛状根中的积累，其中隐丹参酮含量最高达到对照的33.6倍，2%和4%SpFFMy处理使丹参毛状根中总丹参酮含量最多分别达到了对照的9.2和12.6倍；SpFFMy对丹参毛状根中水溶性酚酸类物质的影响则并不一致，SpFFMy通过阻断迷迭香酸向丹酚酸B的生物合成途径的方式促进了迷迭香酸在毛状根中的积累，同时显著抑制了丹酚酸B含量；此外，SpFFMy处理还促进了丹参素在毛状根中的积累，并抑制了丹酚酸A和肉桂酸的含量。（2）接种时间影响SpFFMy对丹参毛状根生长和次生代谢物积累量。在第0天使用3%SpFFMy对毛状根进行诱导显著抑制了毛状根生物量的积累，在第7和第14天接种3%SpFFMy毛状根生物量与对照相比没有发生明显的变化，而第21天接种3%SpFFMy则会促进毛状根生物量的积累，但高浓度的SpFFMy显著抑制毛状根生物量；第0天3%SpFFMy，第21天3%和9%SpFFMy处理对总丹参酮含量的促进作用最为明显，三种处理在第45天总丹参酮含量分别达到对照的9.0、9.0和9.3倍，但由于第21天3%SpFFMy处理促进了毛状根生物量的积累，所以第21天3%SpFFMy处理的总丹参酮产量高于其他处理。第21天3%SpFFMy处理促进了丹参毛状中的迷迭香酸含量，最高使迷迭香酸含量相较于对照增加了40.3%，但其他时间和浓度处理则对毛状根中迷迭香酸含量影响不大；但各个处理均明显抑制了丹酚酸B在毛状根中的积累。（3）密旋链霉菌Act12的无细胞发酵液显著影响丹参毛状根的初生和次生代谢。丹参毛状根接种密旋链霉菌Act12的无细胞发酵液（CellFreeFermentationFiltrate，CFFF）后，促进了丹参毛状根生物量，3%CFFF在处理后丹参毛状根的生长量最多增长了15.8%，CFFF对毛状根中可溶性总糖的积累也具有促进作用，同时抑制丹参毛状根中的可溶性蛋白的积累；CFFF对丹参毛状根中丹参酮合成也有显著的促进作用，其中对隐丹参酮含量的促进最为明显，3%和6%CFFF处理分别使毛状根中隐丹参酮含量最多达到对照的35.3和34.2倍；二氢丹参酮I含量最多为对照的20.0和29.1倍，3%和6%CFFF处理使丹参毛状根中总丹参酮含量最多达到了对照的9.8和9.0倍，同时，丹参酮产量最高达到了对照的11.4和9.5倍；CFFF也通过阻断迷迭香酸向丹酚酸B的生物合成途径的方式促进了迷迭香酸在毛状根中的积累，同时显著抑制了丹酚酸B含量，CFFF处理还提高了丹参毛状根中丹参素的含量，但对丹酚酸A，咖啡酸和肉桂酸的含量则没有产生明显的影响。（4）SpFFMy和CFFF提高丹参毛状根中的参酮含量的机理在于二者均能显著上调丹参毛状根中丹参酮生源途径上关键酶基因的表达。4%CFFF处理促进了丹参毛状根的生长，而4%SpFFMy处理则显著抑制了生物量的积累，SpFFMy和CFFF处理均能够促进毛状根中可溶性糖的积累，但4%SpFFMy处理对可溶性蛋白含量的抑制作用却明显强于4%CFFF处理；4%SpFFMy和CFFF处理均能上调HMGR,DXS,DXR和GGPPS基因的表达，使得毛状根中丹参酮含量显著上升，4%Act12处理显著上调GGPPS基因的表达，在处理后的第7天达到对照的59.6倍，同天4%CFFF仅达到对照的10.2倍，在整个收获期内4%SpFFMy处理的GGPPS基因的相对表达量也始终高于4%CFFF处理，且4%SpFFMy处理对毛状根中丹参酮I和丹参酮IIA含量的促进作用要强于4%CFFF处理，所以我们推测丹参酮I和丹参酮IIA在毛状根中的积累可能与GGPPS基因的表达有着更为密切的关系。丹参酮生源途径的三种前体物质均为糖代谢的中间产物，SpFFMy和CFFF处理后毛状根的糖代谢得到促进也为丹参酮生物合成提供了足够的原料。（5）活性氧在SpFFMy影响丹参毛状根生长和丹参酮积累的作用中发挥着重要作用。本研究表明，4%SpFFMy处理抑制毛状根的生长，生物量最多相对于对照下降了8.2%，活性氧（ROS）抑制剂CAT和SOD能缓解SpFFMy处理对生物量的抑制作用；SpFFMy诱导后丹参毛状根中活性氧含量上升，HMGR和DXR基因表达同步上调，最高分别达到对照的32.4和4.8倍，毛状根中丹参酮积累增加，最高达到对照的10.2倍；在SpFFMy处理中加入活性氧抑制剂CAT和SOD后，毛状根中的活性氧含量显著下降，HMGR和DXR基因表达也明显同步下降，毛状根中丹参酮含量较SpFFMy处理下降了74.6%。以上结果说明活性氧介导了SpFFMy诱导丹参酮积累，SpFFMy很可能是通过ROS信号通路激活了MVA和MEP途径，从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。（6）CFFF和酵母提取物协同诱导丹参毛状根可以显著提高毛状根中隐丹参酮含量。3%CFFF处理促进了丹参毛状根生物量的积累，最多相对于对照增加了12.0%，单独使用酵母提取物YE则对丹参毛状根生物量积累产生明显的抑制，相对于对照最多下降了19.6%，而CFFF+YE处理则抵消了YE对毛状根生物量积累的抑制作用；CFFF+YE处理对隐丹参酮积累的促进作用相当显著，隐丹参酮含量在处理后的第11天达到最大值2.46mg·g-1DW，远高于YE处理的最大值1.52mg·g-1DW和CFFF处理的最大值1.08mg·g-1DW，但CFFF+YE处理和CFFF处理对丹参酮I和丹参酮IIA含量的影响则没有显著差异，CFFF+YE处理下的二氢丹参酮I含量虽然在处理后的前11天高于CFFF处理，但在处理后的14天也和CFFF处理相当。表明在CFFF存在的情况下，YE对一些种类的丹参酮积累的促进作用并没有能够表现出来。（7）丹参根系内生细菌可以显著影响丹参毛状根的生长和次生代谢。五种内生细菌（B1，Pseudomonasbrassicacearumsubsp.Neoaurantiaca；B2，Rhizobiumradiobacter；B3，Pseudomonasthivervalensis；B4，Pseudomonasfrederiksbergensis；B5Pseudomonasthivervalensis）抑制PAL和TAT活性，B3处理使PAL活性最多下降了46.20%，B2处理使TAT活性最多下降了44.70%；同时五种内生细菌可以分解RA和SAB，所以RA和SAB的积累受到显著抑制，其中B2处理对两种物质的最大抑制率达到94.51%和89.02%。五种丹参根中的内生细菌都抑制丹参毛状根生长。其中B2和B4处理分别使毛状根的生物量相对于对照下降50%以上；丹参毛状根则促进B4和B5的生长，抑制B1和B3的生长；除B5处理，其余四种供试丹参根系内生细菌能显著提高丹参酮合成相关的关键酶HMGR和DXS的活性。其中B1处理最高使HMGR活性达到对照的2.1倍，B2处理最高使DXS活性达到对照的5.0倍，由于HMGR和DXS活性的提高，毛状根中的丹参酮含量也明显增加，B1处理使DT-I和CT含量分别达到对照的19.2倍和11.3倍，总丹参酮含量最高达到对照的3.7倍。上述结果表明，丹参根系内生细菌中存在对丹参次级代谢作用有强烈调节作用的细菌。利用内生细菌为试验材料，可以深入探索内生细菌对丹参次级代谢产物合成调节的分子机制，最终达到提高丹参特定次生代谢物产量的目的。
【作者】阎岩；
【导师】梁宗锁；
【作者基本信息】西北农林科技大学，药用植物，2014，博士
【关键词】丹参毛状根；密旋链霉菌Act12；内生细菌；次生代谢；

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