布鲁斯锥虫精氨酸甲基转移酶6和7的结构与酶活研究

布鲁斯锥虫精氨酸甲基转移酶6和7的结构与酶活研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-07 分类:期刊论文 喜欢:2691
师大云端图书馆

【摘要】精氨酸甲基化在基因表达调控,RNA代谢,细胞信号转导及DNA修复等过程中发挥重要的作用。这个过程是由精氨酸甲基转移酶催化(PRMT)的,以腺苷甲硫氨酸(AdoMet)为甲基供体,生成腺苷高半胱氨酸(AdoHcy)和甲基化精氨酸。根据甲基化精氨酸产物的不同,精氨酸甲基转移酶被分为Ⅰ类,Ⅱ类和Ⅲ类。TbPRMT6是哺乳动物PRMT6在布鲁斯锥虫中的同源物,TbPRMT6和人源PRMT6具有31%的序列同源度。TbPRMT6在克鲁斯士锥虫和硕大什曼原虫中也都有同源物,同源率分别高达57%和47%。TbPRMT6的N-端缺少核定位的信号肽,所以绝大部分的TbPRMT6定位于细胞核中,只有一少部分存在于细胞质中。与TbPRMT1,TbPRMT5和TbPRMT7宽泛的底物特异性不同,TbPRMT6具有较窄的底物特异性,包括小牛胸腺组蛋白H3,H4和自己本身。在之前的报道中,删除TbPRMT1,TbPRMT5和TbPRMT7对锥虫的生长没什么影响。虽然TbPRMT6体内的底物还没有被鉴定,但是TbPRMT6的缺失引起锥虫细胞生长速率的下降,说明TbPRMT6对锥虫的细胞生长有重要的作用。此外,TbPRMT6的删除还导致细胞分裂缺陷,这说明TbPRMT6也可能在锥虫的细胞分裂中发挥重要的作用。为了研究TbPRMT6的结构,我们解析了TbPRMT6和TbPRMT6-AdoHcy复合物的结构。与之前解析的第Ⅰ类PRMTs的结构相比,TbPRMT6展示出多个不同的结构特征,包括四段插入序列,β15的缺失和独特的二聚手臂。通过对TbPRMT6和TbPRMT6-AdoHcy的结构比较,我们发现AdoHcy的结合引起TbPRMT6活性位点附近的构象调整。我们用等温滴定量热实验证明AdoHcy引起的构象调整对TbPRMT6结合底物小肽起到关键的作用。免疫印迹和质谱学的结果表明TbPRMT6在体外可以对称性二甲基化牛组蛋白H4R3,但是不能催化锥虫组蛋白的小肽。TbPRMT7是哺乳动物PRMT7在布鲁斯锥虫中的同源物,TbPRMT7和人源PRMT7有27.7%的同源度。TbPRMT7是第一个被清晰地表征的第Ⅲ类PRMT。更重要的是,TbPRMT7缺少C-端的AdoMet结合结构域并展现出很强的酶活,使得TbPRMT7成为一个很好的体系来研究第Ⅲ类PRMTs独特的产物特异性。为了理解TbPRMT7严格的单甲基化活性的起源,我们解析了TbPRMT7酶活结构域和AdoHcy及小肽底物H41-21的复合物结构。在活性口袋中,H41-21的靶标精氨酸R3的胍基和TbPRMT7的残基E172,E181和Q329形成五个氢键。这五个氢键把R3的侧链胍基固定在活性口袋中,使Nη2原子处于适合对AdoMet上的S-甲基发起亲核攻击的位置。TbPRMT7的酶活口袋比可以生产二甲基精氨酸的第Ⅰ类和第Ⅱ类PRMTs的口袋都要窄一些。ITC实验显示单甲基化的小肽H4R3me11-21与TbPRMT7结合的亲和力比非修饰的底物小肽H41-21的亲和力降低了大约30倍。结构模拟显示在TbPRMT7的催化口袋中,MMA上的甲基和周围残基形成了严重的位阻效应。总之,我们的结构分析和生化结果说明TbPRMT7的催化口袋较小,不能很好的结合MMA并催化第二甲基化,这些从结构生物学的角度为TbPRMT7严格的单甲基化活性提供了解释。
【作者】王崇元;
【导师】施蕴渝;吴季辉;
【作者基本信息】中国科学技术大学,结构生物学,2014,博士
【关键词】精氨酸甲基转移酶6;精氨酸甲基转移酶7;甲基化精氨酸;锥虫;

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