p38抑制剂BIRB796逆转膜转运蛋白ABCB1介导的肿瘤多药耐药作用及其机制研究

【摘要】目的：ATP结合盒膜通道转运蛋白(ATP-bindingcassette,ABCtransporters)是肿瘤多药耐药(multidrugresistance,MDR)的重要原因之一。与肿瘤MDR关系最为密切的是P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp/MDR1/ABCB1)、多药耐药性相关蛋白(multidrugresistanceassociated-proteins,MRPs/ABCCs)和乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceprotein,BCRP/ABCG2/MXR)=p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)通路是MAPK介导信号通路的重要分支,参与炎症、增殖、凋亡等多种生理过程。目前发现多个p38MAPK抑制剂能够增强肿瘤对化疗药物的敏感性,但机制尚不明确。因此我们选取了已进入Ⅲ期临床试验的新一代p38抑制剂BIRB796作为研究对象,探讨它是否能后逆转ABC转运蛋白介导的MDR。方法：MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)法检测细胞毒实验；流式细胞仪检测阿霉素、罗丹明123在细胞内的积累；以KBV200细胞建立裸鼠移植瘤模型探讨BIRB796体内逆转活性；蛋白测定用Westernblotting法;ABCB1在mRNA表达水平用PCR和RT-PCR法测定；ATPase试剂盒测定BIRB796对ABCB1ATPase活性的影响；瞬时干扰RNA法观察沉默p38后,用MTT法检测紫杉醇对KBV200细胞的细胞毒性；Docking实验模拟BIRB796与ABCB1的结合位点。结果：本研究通过MTT法证实了p38MAPK抑制剂BIRB796能够特异性的逆转ABCB1所介导MDR,但对ABCG2和ABCC1介导MDR却无逆转作用。通过流式细胞仪检测证明了BIRB796是通过增加ABCB1的底物(罗丹明123和阿霉素)在细胞中的浓度来实现逆转效果的。我们利用高表达ABCB1的KBV200细胞建立MDR裸鼠移植瘤模型,进一步验证了BIRB796在裸鼠体内逆转效果。Westernblot以及PCR/RealtimePCR结果显示BIRB796不改变ABCB1在蛋白和mRNA水平的表达。通过Pgp-GloTM试剂盒检测ABCB1ATPase的活性实验证明了BIRB796是通过调节ABCB1的ATP水解酶的活性来从而抑制了ABCB1的外排功能。通过瞬时干扰p38MAPK,证明了p38信号通路对BIRB796逆转ABCB1介导MDR没有协同作用。通过Docking分析发现BIRB796最有可能与ABCB1的位点1结合,并模拟出二者之间的可能存在的分子间相互作用。我们推断分子间的疏水作用最有可能是BIRB796与ABCB1药物结合位点1的原因。结论：1、BIRB796能够特异性的逆转ABCB1所介导MDR,方式是通过增加ABCB1的底物(罗丹明123和阿霉素)在细胞中的浓度。2、BIRB796对ABCG2和ABCC1无逆转作用.3.BIRB796’恢复KBV200裸鼠移植瘤模型对紫杉醇的敏感性,但并不增加紫杉醇在裸鼠体内的毒性。4、BIRB796不影响ABCB1的蛋白和mRNA水平的影响。5.BIRB796双向调节ABCB1ATPase活性,来实现抑制ABCB1外排功能。6、p38信号通路对BIRB796逆转ABCB1介导的MDR无协同作用。7、Docking分析模拟出BIRB796与ABCB1位点1之间可能存在的分子间相互作用,疏水作用最有可能是二者之间结合的主要原因。
【作者】何丹；
【导师】张国庆；
【作者基本信息】新疆医科大学，外科学（专业学位），2013，博士
【关键词】多药耐药；ABCtransporters；ABCB1/P-gp；p38MAPK；BIRB796；

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