Hedgehog信号通路调控牛肌卫星细胞增殖和分化的研究

【摘要】Hedgehog（Hh）信号通路是动物机体生长发育以及维持正常生命活动所不可缺少的一个信号通路，几乎所有动物组织其正常功能的发挥都离不开这一通路的调控。在多种中胚层来源的细胞中的研究也表明，Hh信号通路对于这些细胞的增殖及分化有着重要的调控作用。肉牛肌肉的生长状态及结构直接影响着牛肉的产量和肉质，而肌肉中的卫星细胞（MuSC）作为出生后肌肉生长和损伤修复的后备力量，它的活动和活力对于肌肉生长发育有着很关键的作用。本文即通过检测体内肌肉组织的基因表达量和检测体外的MuSC的增殖及分化相关活动，研究Hh信号通路在肌肉组织及细胞中的表达情况，并通过Hh信号通路的抑制剂cyclopamine和激动剂purmorphamine研究Hh信号通路的活性对于MuSC增殖和分化的影响。在本研究中，采用荧光实时定量PCR的方法检测了秦川牛各组织中、肌肉来源的各种细胞中以及MuSC增殖和分化过程中相关基因的相对表达水平；通过细胞流式技术等检测了MuSC的增殖程度和细胞周期的比例；通过分别使用含2%马血清的培养液和含有胰岛素等药物的培养液对分离的牛MuSC进行了成肌和成脂诱导；另外还通过腺病毒介导的C/EBPα和ADIG基因的过表达诱导牛MuSC的成脂分化，并进行了相关检测。秦川牛各个组织的基因相对表达量显示，在所检测的13个组织中，Hh信号通路关键成员Ptch1、Smo、Gli1以及Gli2的基因表达量均在肌肉中最低。而且在从肌肉中分离出来的后贴壁的成肌细胞含量更高的细胞类群中，Hh信号通路的关键成员的基因表达水平也低于较早贴壁的细胞类群。因此认为Hh信号通路成员在成年牛肌肉中的基因相对表达量处于相对较低的水平，而且通常情况在具有分化潜能的成肌细胞中也处于相对较低表达的水平。成功分离出了较高纯度的牛MuSC，并经免疫细胞化学鉴定其CD34以及成肌相关标记均为阳性，说明其主要由成肌细胞组成。在牛MuSC增殖过程中，cyclopamine能够抑制细胞的生长，并且使G1期细胞的比例增多，而且细胞周期蛋白cyclinE2的表达量的峰值出现时间较对照组以及purmorphamine处理组滞后。可以推测，Hh信号通路特异抑制剂cyclopamine能够延缓牛MuSC的细胞周期，并且抑制牛MuSC的增殖能力。而且从不同浓度cyclopamine处理下的细胞生长曲线可以看出，这种抑制能力呈浓度依赖性的作用方式。在牛MuSC成肌分化过程中，cyclopamine处理使得形成肌管的数量减少，而purmorphamine则能使肌管形成的数量和维持时间都增加。在成肌分化启动以后，Hh信号通路的几个关键成员的基因表达量都出现了不同程度的上调。而且，成肌相关的关键因子MyoD、MyoG以及Pax7的基因表达量在用purmorphamine处理时表现出更高的水平，而在cyclopamine处理组中则反之。由此推断，Hh信号通路成员的基因表达在牛MuSC成肌分化开始的时候被激活；抑制Hh信号通路的活性能够抑制牛MuSC的成肌效果，反之，活化Hh信号通路则能促进牛MuSC的成肌效果。在牛MuSC成脂过程中，cyclopamine处理对脂滴形成的影响不明显，但是purmorphamine处理的细胞中形成的脂滴较少。在采用不同方法实现的牛MuSC的成脂过程中，Hh信号通路关键成员的基因表达均持续下降。但是Hh信号通路的调节物对于成脂过程中相关因子的基因表达量的影响则不明显。虽然抑制Hh信号通路活性对牛MuSC的成脂效果并没有明显的作用，但是提高Hh信号通路的活性对其成脂效果则有抑制作用。综上所述，Hh信号通路的活性对于牛MuSC的增殖活动和成肌分化有正向的调节作用，而对于其成脂过程则是负向的作用关系。
【作者】刘扬；
【导师】昝林森；
【作者基本信息】西北农林科技大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】cyclopamine；purmorphamine；成肌；成脂；细胞周期；

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